一、基本原理
通过抗原与抗体的特异性免疫反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗原也可以是抗体。
ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化水解或氧化还原反应而成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
所生成有色产物的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强。
二、ELISA实验方法
ELISA根据不同的设计可以分为直接法、间接法、夹心法和竞争法。
1.直接ELISA：降抗原通过吸附等方法直接固定在固相载体上，经过洗涤后，加入酶偶联的的检测抗体结合。然后加入底物，酶催化底物产生与待测抗原的量成正比的显色信号。直接ELISA常用于评估抗体的亲和力和特异性、研究阻断/抑制相互作用。直接ELISA具有快速、操作简单的特点，但由于仅使用一种抗体，特异性较低，可能会产生较高的背景信号。
2.间接ELISA：将抗原通过吸附等方法直接固定在固相载体上，经过洗涤后，先添加能与抗原特异性结合的一抗进行孵育，再次清洗后，通过添加对一抗种属具有特异性的酶偶联的二抗来检测结合的一抗。在底物的存在下，酶催化底物产生与待测抗原的量成正比的显色信号。间接ELISA是直接ELISA的基础上加入在酶标记的二抗进行检测的一种常见形式，常用于内源性抗体的检测。间接ELISA利用二抗进行了扩增，特异性较直接ELISA好，但二抗可能会引起交叉反应。
3.夹心ELISA：夹心ELISA是最常见的ELISA类型。两种特异性抗体用于夹住抗原，通常称为匹配抗体对。将捕获抗体包被在固相载体上，清洗掉多余未结合的捕获抗体后，加入样品，样品中的目标抗原被特异性捕获。再次清洗后，产生与样品中存在的目标抗原的量成正比的信号。夹心ELISA需要两种抗体才能与目标抗原结合，具有高度特异性，能与复杂的样本基质兼容，常用于生物样本中目标抗原的浓度检测，但操作步骤较为繁琐。
4.竞争性ELISA：与夹心ELISA类似，捕获抗体包被在固相载体上。不使用酶偶联的检测抗体，而是使用酶偶联的抗原与样品中的目标抗原竞争性与捕获抗体结合。样本中存在的目标抗原越多，与捕获抗体结合的酶偶联抗原就越少。加入底物后，产生的信号与样品中存在的目标抗原的量成反比。竞争性ELISA通常用于目标抗原太小而无法有效的与两种抗体形成夹心的情况，如小分子和激素的浓度测定。竞争性ELISA只使用一种抗体，相对于夹心ELISA的特异性较低，并且需要偶联抗原。
三、注意事项：
1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2.在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1)固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
(2)包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3)酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4 ) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。
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