PCR、RT-PCR 和 qPCR：哪种技术是你的科研助手？

  聚合酶链式反应(PCR)是一种相对简单且广泛使用的分子生物学技术，用于扩增和检测DNA和RNA序列。与传统的DNA克隆和扩增方法相比，PCR只需要数小时，具有快速、高效和特异性强。因为实验需求，目前在PCR基础上改进。大家在实验中还接触到了RT-PCR和qPCR。今天，上海通蔚给大家来介绍一下它们之间的区别。

  PCR

  聚合酶链反应，也就是PCR（polymerasechainreaction）技术，这是一种使用DNA聚合酶拷贝选定DNA区域的技术，由KaryMullis及同事在20世纪80年代发明，KaryMullis也因此被授予了诺贝尔化学奖。PCR常用于基因克隆、基因分析、基因诊断、DNA指纹识别等领域。

  PCR实验前需要 DNA聚合酶、镁、核苷酸、引物、待扩增的DNA模板和热循环仪。PCR由三个步骤组成：变性-退火-延伸。

  模版DNA变性：双链DNA经加热至93℃左右一定时间后，使其解离使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

  模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结；

  引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。经过一系列温度和时间的变性、退火和延伸过程称为一个扩增循环。循环的每个步骤都应针对所使用的模板和引物组进行优化。该循环重复大约20-40次，然后通常通过琼脂糖凝胶分析扩增产物。

图1 PCR扩增示意图

  RT-PCR

  逆转录PCR（reversetranscription PCR）或者称反转录PCR（reversetranscription-PCR,RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。RT-PCR灵敏度高，操作简单，常用于基因表达分析、病毒检测、RNA 病毒的定量等领域等。

  RT-PCR和PCR区别在于它是从mRNA模版开始，在逆转录酶的催化下，随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA(complementaryDNA，cDNA)，按照普通PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列。

图2 逆转录RT-PCR原理图

  qPCR

  qPCR实时定量PCR（real-timePCR）是是一种在DNA扩增时（即实时）对其定量的方法，常用于基因表达定量、病原体检测、基因分型。与普通PCR一样，DNA通过三个重复步骤进行扩增：变性、退火和延伸。在qPCR中，荧光标记可以随着PCR的进展收集数据。由于可用的方法和化学物质范围广泛，该技术具有许多优点。在基于染料的qPCR（通常为绿色）中，荧光标记允许通过使用dsDNA结合染料对扩增的DNA分子进行定量。在每个循环期间，测量荧光。荧光信号随复制DNA的数量成比例增加。

图3 qPCR实时定量原理图

  上述为大家介绍了PCR、RT-PCR和qPCR区别，选择哪种技术取决于实验目的和需求。 如果只需要确定是否存在特定 DNA 或 RNA 序列，可以选择 PCR 或 RT-PCR；如果需要精确量化起始模板的含量，则 qPCR 是更好的选择。关于PCR还有疑问，欢迎前来咨询。上海通蔚有上述三种技术的PCR试剂盒，对PCR试剂盒有需要的欢迎前来咨询，我们PCR试剂盒快速、高效、特异性强。