PCR扩增实验轻松上手：图解详解步骤，助您快速掌握

  聚合酶链式反应 (PCR) 有时称为分子复印，传统的聚合酶链式反应 (PCR) 有时称为分子复印，是一种用于放大（复制）样品中痕量 DNA 和 RNA 的技术。PCR 热循环仪用于生产研究所需的大量样品。

  PCR 过程可用于多种实验室和临床应用和目的。法医实验室用它来分析犯罪现场的 DNA 样本。临床医疗保健实验室用它来诊断病毒感染的患者。制药研究实验室使用它来分析和复制 DNA 和 RNA 样本，用于药物和疫苗的制造。

  PCR原理

  在PCR实验过程，需要四种成分（试剂或化学品）如下：

  DNA 或 RNA 样本（来自唾液、血液、头发、皮肤刮屑等）

  （1）、DNA 引物：促进核苷酸互补链合成的短单链 DNA

   （2）、DNA聚合酶：一种有助于合成DNA互补链的酶

  （3）、含有腺嘌呤 (A)、胸苷 (T)、胞嘧啶 (C) 和鸟嘌呤 (G) 的核苷酸溶液混合物，用于构建重复的 DNA 链

  原理分为四步走，如下：

  （1）变性：是利用DNA在体外高温时变性，双链解离变成单链；

  （2）退火：低温时引物与单链DNA按碱基互补配对原则结合；

  （3）延伸：再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’- 3’)的方向合成互补链。

  将这3个步骤重复（“循环”）25-35次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝。

  PCR原理是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。以单链DNA为模板，4种dNTP为底物原料，在引物引导的情况下，模板与底物通过DNA聚合酶的聚合延伸，多次重复后使DNA呈指数扩增复制。

  PCR流程步骤

  PCR过程有 4 个步骤：收集、制备、扩增和 PCR 后清理。PCR 机器步骤发生在扩增步骤中。首先将一段 DNA 样本与上面列出的试剂和化学品一起放入合适的试管中。将管放入PCR 机或热循环仪中。热循环仪通过 3 个步骤处理溶液：变性、退火和延伸。

  PCR扩增实验步骤

  第 1 步 - 变性

  使用热循环仪将管中包含的溶液加热至至少 94°C (201.2°F)。热量会破坏原始 DNA 样品的氢键，并将 DNA 分离成单链（这称为双链 DNA 变性）。

  第 2 步 - 退火

  然后将样品混合物冷却至 50 至 60°C（122 至 140°F），使 DNA 引物和 DNA 聚合酶与通过加热分离的各个 DNA 链结合（这称为 DNA 退火）引物）。此时，添加的混合物溶液中的核苷酸（A、T、C、G）将与加热过程中产生的单独的 DNA 链配对。

  第 3 步 - 扩展

  一旦连接在一起，它们就会形成一条新的互补 DNA 链（称为 DNA 延伸）。因此，由原始样品分子的每条单链形成了新的双链DNA分子副本。温度从 95°C 循环至 50 至 60°C。然后使用热循环器重复该循环约 35 至 40 次，热循环器自动重复该过程的加热和冷却循环。每次循环仪进行加热/冷却循环时，所得 DNA 序列都会加倍。因此，最初来自一个样本的一小段 DNA 在 35 个倍增循环后可以被扩增形成数百万个拷贝。

  PCR 流程循环

  PCR 三个主要步骤的流程图，包括 PCR 温度循环、循环次数和总程序长度

  该过程提供了由原始样品分子的每条单链形成的新的双链DNA分子副本。这个三步过程需要进行 35 到 40 次，才能将 DNA/RNA 扩增成数百万个重复片段。

  第 4 步 - 电泳分析

  一旦 PCR 过程完成，所产生的扩增（复制）片段就可以与已知来源的其他核苷酸片段进行比较。然后将 PCR 生成的核苷酸序列放置在分离凝胶中的人类、病原体或其他来源的已知核苷酸序列旁边。然后电流通过凝胶，凝胶内的各种核苷酸序列根据其电荷和分子大小形成类似梯子的带。这称为凝胶电泳。在凝胶中迁移到相同水平的条带或梯状台阶显示了核苷酸序列的同一性。这种方法是完成 PCR 测试最流行的方法之一。

  定量PCR

  qPCR 是传统 PCR 的一种变体，允许在通常的 40 个循环过程中使用荧光染料实时分析扩增/复制的 DNA。荧光染料附着在一些核苷酸链上，允许用户在扩增/复制循环期间测量特定产物及其数量。qPCR 使用特殊的热循环仪，称为实时热循环仪。除了加热和冷却装有 PCR 试剂的管子外，他们还可以在每个循环中测量管内的荧光。这使得用户可以跳过 PCR 产物最终分析所需的凝胶电泳或其他辅助程序，从而更快地产生结果。