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竞争性 ELISA法详解

发布时间:2024-01-16     发布作者:上海通蔚生物

  竞争性 ELISA法是一种用于估计样本(例如血清)中存在的抗体的技术。原理如下:

  1.其原理是使用两种特异性抗体,一种与酶结合,另一种存在于检测血清中(如果血清抗体呈阳性)。


  2.两种抗体之间会发生针对相同抗原的竞争。


  3.出现颜色表明测试呈阴性(不存在抗体),而没有颜色则表明测试呈阳性(存在抗体)。


  4.竞争性 ELISA 的是原始抗原(样品抗原)和添加抗原执行的竞争性结合过程。


  5.其他形式的 ELISA 相比,竞争性 ELISA 的程序在某些方面有所不同。


  竞争性 ELISA 的步骤


  1.一抗(未标记)与样品抗原一起孵育。


  2.然后将抗体-抗原复合物添加到预先涂有相同抗原的孔板中。


  3.通过清洗板去除未结合的抗体。(样品中的抗原越多,能够与孔中的抗原结合的抗体就越少,因此“竞争”。)


  4.添加对一抗具有特异性并与酶缀合的二抗。


  5.添加底物,其余酶引发显色或荧光信号。



  竞争性 ELISA结果


  1.在此检测中,微量滴定孔涂有抗原。


  2.将待测血清添加到这些孔中并在 37°C 下孵育,然后洗涤。


  3.如果测试血清中存在抗体,则会发生抗原抗体反应。


  4.通过添加酶标记特异性抗体来检测抗原抗体反应。


  5.在阳性测试中,没有留下任何抗原供这些抗体发挥作用。因此,抗体保持游离状态并在洗涤过程中被洗掉。


  6.添加底物后,没有酶可以对其起作用。因此,没有颜色反应表明阳性结果。


  7.在阴性测试中,血清中不存在抗体,包被孔中的抗原可与酶结合的抗体结合,酶作用于底物产生颜色。


  竞争性 ELISA的优点


  1.高特异性,因为使用了两种抗体并且特异性捕获和检测抗原/分析物


  2.适用于复杂样品,因为抗原在测量前不需要纯化


  3.灵活性和灵敏度,因为可以使用直接和间接检测方法


  竞争性 ELISA实验方案


  对于大多数应用,聚氯乙烯 (PVC) 微量滴定板是最好的。


  1.50 μL 稀释的一抗(捕获)添加到每个微量滴定孔中。孵育 4 小时。室温或 4°C 过夜。


  注意:如果没有纯化的捕获抗体,则应首先根据以下步骤用针对捕获抗体宿主的纯化二抗包被板:



  •   通过向每个孔中添加约 50 μL 抗体溶液(磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的 20 μg/mL),将未标记的二抗结合到每个孔的底部。
  •   将板在 4°C 下孵育过夜,以实现完全结合。
  •   添加一抗(如上所述)。



  2.PBS 清洗孔两次。可以通过将板轻拂到合适的容器上来去除抗体溶液洗液。


  3.微量滴定板上剩余的蛋白质结合位点必须通过与封闭缓冲液一起孵育来饱和。用 3% BSA/PBS 0.02% 叠氮化钠将孔填充到顶部。孵育2小时。至室温下在潮湿气氛中过夜。


  4.PBS 洗孔两次。


  5.50 μL 标准品或样品溶液添加至孔中。所有稀释均应在封闭缓冲液(3% BSA/PBS 0.05% Tween-20)中进行。


  注意: 叠氮化钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。如果使用 HRP 标记的缀合物进行检测,请勿在缓冲液或洗涤溶液中加入叠氮化钠。


  6.50 μL 抗原结合物溶液添加到孔中(应滴定抗原溶液)。所有稀释均应在封闭缓冲液(3% BSA/PBS 0.05% Tween-20)中进行。孵育至少 2 小时。在室温潮湿的气氛中。


  7.PBS 将板洗四次。


  8.添加基材。经过建议的孵育时间后,可以在 ELISA 读数器上测量目标波长的光密度。


最后,上述竞争性 ELISA法仅供参考,每个厂家elisa试剂盒不同,具体的可以详情参考说明书。文中只是给大家详细介绍一下elisa实验具体的方案。