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elisa试剂盒底物原理

发布时间:2024-01-12     发布作者:上海通蔚生物

  ELISA,一种酶联免疫吸附测定法,是一种基于分析板的生化免疫测定法。它广泛应用于生命科学和生物化学实验室,用于生物分子的定量,例如蛋白质、抗体、肽、糖蛋白和激素。

 

  该技术利用抗原和抗体之间的相互作用来产生可测量的结果。抗原是一种启动免疫反应的外来蛋白质,其中可能包括与抗体复合后的一系列反应。抗体是生物体免疫系统产生的蛋白质。ELISA测定中涉及的两种抗体是一抗和二抗。关于抗原和抗体可以参考《免疫学检测:一抗和二抗简介

 

  在该技术中,抗原被固定在ELISA板的表面,然后与酶缀合物抗原特异性抗体一起孵育。这导致抗原-抗体复合物的形成。然后使用特定底物和合适的检测方法,通过孵育含有抗原-抗体复合物的ELISA板来检测反应产物。

 

  在实验室遵循的通用ELISA方案包括以下步骤:

 

  1、抗原固定在ELISA板的表面。

 

  2、使用封闭缓冲液覆盖板的其余部分。

 

  3ELISA板与抗原在室温下孵育抗原特异性抗体。

 

  4、使用读板器测量反应产物或获得的信号。

 

  ELISA的最后一步是将含有反应混合物的ELISA板与合适的底物一起孵育。底物的使用取决于您使用的检测方法,并与抗体酶联,例如辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶(AP)。这有助于信号放大和板中发生的反应的可视化。

 

  ELISA应用中常用的一些底物是过氧化氢、鲁米诺和对硝基苯磷酸盐(pNPP底物)。

 

  在本文中,上海通蔚生物将介绍这些底物在ELISA测定过程中的工作原理、它们的功能以及它们在不同医疗和生物技术实验室和行业中的应用。

 

  ELISA底物如何工作?

 

  ELISA底物通过与缀合的酶结合来检测测定中使用的抗体。该酶将底物转化为有色产物或荧光或电化学信号,使用分光光度计、分光荧光计或电化学装置获取其吸光度或读数,以定量给定样品中的抗原。

 

  不同的底物在与酶的氧化反应过程中产生不同的颜色。例如,辣根过氧化物酶底物与HRP酶反应后产生以下结果:

 

  1、ABTS2,2-Azinobis[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐):绿色

 

  2、TMB3,3,5,5-四甲基联苯胺):橙色

 

  3、OPD(邻苯二胺):蓝色

 

  产生的颜色量或获得的信号量与与固定在96孔板表面的抗原结合的一抗的量成正比。



 

  图:HRP酶与其底物之间抗原抗体复合物形成和氧化反应的图示

 

  获得高质量、一致、可靠的蛋白质测量结果。如今,研究人员使用ELISA试剂盒。这些检测试剂盒配备了运行特定ELISA检测所需的所有合适试剂。它们执行起来既简单又快捷。此外,它们具有最低的测定间和测定内变异性、高灵敏度和最高可能的批次间一致性。

 

  市场上还有一些底物试剂盒,配有适合ELISA检测步骤的酶-底物试剂配方。它们使这个过程更快更容易。

 

  ELISA底物类型

 

  根据所使用的检测方法,ELISA底物分为以下几类:

 

  化学发光底物

 

  报告酶-底物反应中产生的光用作化学发光检测系统的信号。用于HRP酶的化学发光底物溶液包括鲁米诺。AP酶需要基于1,2-二氧杂环丁烷的试剂来产生X射线胶片或电荷耦合器件(CCD)相机捕获的信号。

 

  为了提高化学发光信号的强度、持续时间和灵敏度,检测过程中还使用了增强化学发光底物(ECL)。然而,应稀释底物以防止错误的高强度信号。

 

  显色底物

 

  这些底物与报告酶反应产生有色的不溶性反应产物,并使用分光光度计进行检测。该方法中使用的HRP底物包括2'-嗪双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)5-氨基水杨酸(5-AS);3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB);和邻苯二胺(OPD)。

 

  AP酶的底物是5--4-氯吲哚基磷酸盐(BCIP)和硝基蓝四唑(NBT)。通过使用终止溶液可以增强所得的比色信号,以获得更准确的信号测量。


 

  图:显色检测方法的机制说明

 

  荧光底物

 

  荧光ELISA底物需要荧光计能够产生正确的激发光束,以便荧光标签发出信号。荧光计通过其激发和发射滤光片测量信号。

 

  ELISA测定中使用的荧光AP底物是4-MUP4-甲基伞形磷酸酯),它在440 nm的发射波长和360 nm的激发波长处产生信号。HPPA3-对羟基苯基丙酸)和HPA(羟基苯基乙酸)底物与过氧化物酶配对。



 

  图:荧光检测机制的图示。

 

  为您的ELISA测定选择合适的底物取决于灵敏度(较低或较高的检测限)、时间要求以及过程中需要/使用的检测设备的类型。

 

  ELISA底物有何用途?

 

  ELISA底物对于ELISA测定中获得的信号的检测、放大和定量至关重要。它们与酶发生反应,产生有色产物或信号,并使用合适的设备进行测量。

 

  ELISA检测

 

  ELISA是一种用于识别和定量生物分子(例如蛋白质、肽、糖蛋白和激素)的生化测定法。ELISA的最后一步是对含有抗原抗体(与荧光团或酶结合)复合物的反应混合物以及用于反应可视化的合适底物进行孵育的ELISA板。

 

  底物与HRPAP酶反应,产生不溶性有色反应产物或信号,由仪器、分光光度计或分光荧光计进行测量。

 

  哪些行业使用ELISA底物?

 

  HRPAP是两种最常用的酶,用于在ELISA检测中结合抗体来检测抗原。这主要是因为它们的简单性和高灵敏度。

 

  在测定中,它们与合适的底物发生反应,产生用于抗原分析的可测量信号。因此,ELISA底物是ELISA方案的关键组成部分之一,并用于许多不同的实验室和行业。

 

  制药

 

  制药行业使用ELISA测试来检测多种疾病,例如流感、艾滋病毒、登革热和莱姆病。市场上还有一些ELISA试剂盒,可以使工作流程更快、更轻松。

 

  此外,ELISA测定在疫苗开发中也至关重要。它们检测针对故意注射到宿主体内的抗原而形成的抗体。

 

  食品工业

 

  在食品工业中,ELISA检测用于检测制成品中的食品过敏原,特别是涉及牛奶、杏仁、花生、核桃和鸡蛋。它可以防止食品中的欺诈性替代品并证明其在市场上的真实性。