什么是PCR？一文带你了解聚合酶链式反应的全过程

  什么是PCR（聚合酶链式反应）？PCR 是一种在实验室中使用的技术，用于复制特定 DNA 片段的数百万个副本。聚合酶链式反应 (PCR) 最初由美国生物化学家 Kary Mullis 于 1983 年开发。因其开创性工作，他于1993年荣获诺贝尔化学奖。在Covid-19 大流行期间，通过PCR技术检测一个人是否感染该病毒。
  

  PCR是如何工作呢？

  

    PCR反应体系及作用

  1、要复制的 DNA 模板。
  
  2、引物——DNA 或 RNA 的短片段，长度为 20 到 30 个碱基，结合感兴趣的 DNA 片段的任一侧并标记 PCR 的起始点。
  
  3、DNA 核苷酸碱基（也称为 dNTP）。 DNA 碱基（A、T、C 和 G）是 DNA 的组成部分，是构建新 DNA 链所必需的。
  
  4、一种称为 Taq 聚合酶的酶，它将碱基添加到复制的序列中。
  

  5、缓冲液以确保反应有合适的条件。

PCR步骤

  
  PCR 具有三个主要阶段，其中涉及加热和冷却过程：
  
  步骤1，变性：将双链模板DNA加热，使其分离成两条单链。
  
  步骤2，退火：降低温度，使DNA引物附着到模板DNA上。
  
  第三步，延伸：再次升高温度，Taq聚合酶产生新的DNA链。
  
  这三个阶段重复 20-40 次，每次 DNA 拷贝数加倍。这称为热循环，由机器执行。
  
  它是由一台称为热循环仪的机器执行的。根据机器的速度，PCR 可以在不到一小时或长达几个小时内完成。
  

  PCR 完成后，可以使用一种称为电泳的方法来检查产生的 DNA 片段的数量和大小。

聚合酶链式反应 (PCR) 中主要步骤的插图

  

  PCR 的每个步骤详解

  
  第一步：变性
  
  将反应混合物加热至 94-95°C，持续 15 至 30 秒。
  
  高温导致模板 DNA 两条链中碱基之间的氢键断裂，两条链分离。
  
  这会产生两条单链 DNA，它将作为模板产生每条 DNA 链的新副本。
  
  重要的是，在此阶段保持温度足够长的时间，以确保 DNA 链完全分离。
  
  第 2 步：退火
  
  将反应冷却，使引物能够通过氢键连接到单链模板 DNA 上的特定位置。
  
  温度取决于底漆的特性，但通常在 50 至 65⁰C 之间。
  
  两条分离的 DNA 链是互补的，并且以相反的方向延伸（从一端 – 5' 端 – 到另一端 – 3' 端）。因此，有两种引物——正向引物和反向引物。
  
  此步骤至关重要，因为引物通过提供供聚合酶使用的短双链 DNA 区域而充当 DNA 合成的起点。只有引物结合后，聚合酶才能附着并开始在延伸步骤中从松散的 DNA 碱基生成新的互补 DNA 链。
  
  退火步骤通常需要大约10-30秒。
  

  第三步：扩展

  
  热量升至 72⁰C，以便通过添加 DNA 碱基的特殊 Taq DNA 聚合酶生成新 DNA。
  
  Taq DNA 聚合酶是一种取自水生栖热菌 (“Taq”) 的酶：
  
  这种细菌通常生活在温泉中，可以耐受80℃以上的温度，但最适温度为72℃。
  
  该细菌的 DNA 聚合酶在高温下非常稳定，这意味着它可以承受在 PCR 变性阶段将 DNA 链分开所需的温度。
  
  大多数其他生物体的 DNA 聚合酶无法承受如此高温。例如，人类聚合酶在 37°C（体温）下工作效果最佳。
  
  在 72⁰C 时，Taq 聚合酶开始构建互补链。它附着在引物上，然后沿 5' 到 3' 方向将 DNA 碱基一一添加到单链上。
  
  结果是一条全新的 DNA 链和双链 DNA 分子。
  
  此步骤的持续时间取决于被扩增的 DNA 序列的长度。复制 1,000 个 DNA 碱基通常需要大约一分钟。
  
  第四步：重复该过程
  
  这三个热循环过程重复 20-40 次，以产生大量感兴趣的 DNA 序列的副本。
  
  PCR 过程中产生的新 DNA 片段也可以作为 DNA 聚合酶可以附着并开始产生 DNA 的模板。
 

  结果是在相对较短的时间内产生大量特定 DNA 片段的拷贝。

插图显示聚合酶链式反应 (PCR) 如何产生大量 DNA 副本

  上述是通蔚为大家介绍了什么是PCR（聚合酶链式反应），了解PCR原理及步骤，有助于计和执行PCR实验操作。如果您对PCR还有疑问，欢迎前来咨询。