PCR酶发展史

    早期的PCR技术虽然具有突破性意义，但也存在一些局限性，促使科研人员不断努力开发新的PCR酶和设备。本文主要围绕酶发展史，介绍早期PCR存在的问题，以及克服这些问题的新型PCR酶的开发。

    早期PCR存在的问题

    最初，DNA聚合酶I的Klenow片段用于在PCR中扩增DNA。然而，这种酶在高温下不稳定，在PCR每次循环的热变性步骤中失去活性。此外，延伸反应必须在低温（+37°C）下进行。由于这些原因，早期的PCR存在以下问题并且不太方便：

    对于实验者来说非常繁琐（每个循环添加Klenow酶是一项繁琐且重复的任务）

    昂贵（由于使用了大量Klenow酶）

    存在非特异性扩增的可能性（在+37°C时，引物与DNA的非目标区域结合，扩增非特异性区域）

    此外，该技术每次添加新的酶时都需要打开试管，容易受到污染；研究人员必须在整个反应过程中保持在场，这限制了他们一次可以处理的样本数量；并且PCR过程无法轻易实现自动化。

    解决上述问题需要很长时间的研究。在此过程中，新的PCR酶和设备正在开发中。下面我们就来看一下它的历史。

    PCR酶发展史

    科研人员对耐热DNA聚合酶的分离和鉴定，使得通用PCR技术成为可能。TaqDNA聚合酶稳定，在PCR所用的高温（约+72°C）延伸反应条件下表现出最佳活性。TaqDNA聚合酶在PCR重复循环过程中保持稳定，因此无需在每次循环后停止PCR并添加更多酶（Saiki等人，1988）。

    从那时起，人们进行了各种改进，从而开发出更准确、更方便的PCR酶。

    1989

    DavidGelfand和SusanneStroffel（当时在Cetus公司，后来在罗氏分子诊断公司）于1986年纯化了天然Taq酶。勃林格曼（现为罗氏）是供应重组Taq酶的公司之一。

    然而，TaqDNA聚合酶仍有改进的空间。首先，该酶缺乏校对活性，无法纠正扩增过程中发生的转录错误（潜在突变）。在大多数扩增反应中，这些偶然发生的突变并不是什么大问题。然而，对于某些应用（例如扩增基因组DNA以进行测序或等位基因多态性研究），任何转录错误都可能导致错误的结果。

    具有校对活性的耐热DNA聚合酶的发布解决了这个问题，使得需要高度精确的转录反应的应用能够实现高保真PCR。

    1994

    PwoDNA聚合酶是一种具有校对活性的耐热酶，由勃林格曼公司（后来的罗氏公司）于1994年发布。

    提高反应保真度的另一种方法是将TaqDNA聚合酶与耐热酶（例如，TgoDNA聚合酶）或其他具有校对活性的蛋白质相结合。

    1995

    目前已有一款这样的酶混合物——ExpandHighFidelityPCRSystem——上市。

    使用酶混合物代替单一酶为PCR提供了重要的优势，包括校对活性以及扩增更长靶标的能力（Barnes，1994）。

    1996

    经过进一步改进以优化反应，发布了用于扩增长达20kb的目标的酶混合物（扩展长模板PCR系统，于1994年推出）。随后，一种新的酶混合物被发布，它能够扩增长达35kb的目标（Expand20kbPLUSPCRSystem，于1996年推出）。

    改良的TaqDNA聚合酶可实现“热启动PCR”，该PCR在室温下不活跃，但在DNA变性温度下容易被激活（Birch等人，1996年）。这将最大限度地减少麻烦的引物二聚体的形成。

    2000年，FastStartTaqDNA聚合酶

    作为“热启动PCR”应用产品推出(2000)。通过在其酶混合物（FastStart高保真PCR系统，于2003年推出）中添加FastStartTaqDNA聚合酶，罗氏创建了一个能够满足多重PCR和高保真热启动PCR等苛刻应用的系统。

    以上我们介绍了PCR酶的发展和历史。这样发展起来的新型PCR技术现在不仅应用于基础研究，还应用于医疗实践、食品检测和刑事调查等多个领域。