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了解ELISA技术:如何用它来检测免疫球蛋白

发布时间:2024-01-09     发布作者:上海通蔚生物

  通过 ELISA,可以轻松检测和定量溶液中的免疫球蛋白,无论您是在寻找抗原特异性 Ig 还是总 Ig,例如 IgGIgA... 在本文中,将引导您完成不同的检测设置,准备您来解决您的具体研究问题。关于LG,可以参考《什么是抗体


  用抗体检测抗体


  抗体是特异性结合靶分子的蛋白质,因此是脊椎动物免疫系统的核心参与者。在上个世纪,我们人类已经学会利用其独特的特性在实验室中进行应用。最终,我们可以在测定中使用抗体来检测其他抗体。




  图 1. ELISA 中检测 IgG 的三种不同设置的测定原理。抗原特异性 IgG 可以通过 A) 间接或 B) 反向设置进行检测,总 IgG 可以通过 C) 夹心设置进行检测。这是 IgG 评估的示例;可以使用相应的测定抗体对该测定进行修改以检测其他 Ig 同种型或亚类。


  抗原特异性免疫球蛋白


  检测抗原特异性免疫球蛋白的设置与经典的夹心测定不同。最常见的方法是首先将抗原涂覆到板上(图 1A)。或者,可以在反向设置中使用标记抗原(图 1B)。无论您选择哪种设置,请记住,抗原特异性 ELISA 在很大程度上取决于抗原的天然形式或尽可能接近的形式。用于检测的抗原通常是由研究人员自己重组产生的,但有些也可以从市场上购买。


  抗原特异性 Ig ELISA 的典型设置(图 2)包括以下步骤:


  •   利用抗原与塑料的疏水性结合将感兴趣的抗原涂覆在 ELISA 板上。我们建议使用高结合 ELISA 板,例如聚苯乙烯制成的 ELISA 板。


  如果您正在建立全新的检测,请注意抗原上的相关表位可能在包被步骤后被隐藏。如果您怀疑隐藏表位是 ELISA 无效的原因,您可以尝试不同的包被方案。例如,您可以测试不同的包被缓冲液,例如 PBS 7.4 或碳酸氢盐缓冲液 pH 9.5,因为 pH 值会影响氨基酸侧链和聚苯乙烯之间的疏水结合。或者,如果您有标记格式的抗原,您可以测试反向 ELISA 设置(图 1C)。


  •   板涂覆之后是封闭步骤。


  •   添加样品后,抗原特异性免疫球蛋白应与板上包被的抗原结合。


  •   未结合的免疫球蛋白将在随后的洗涤步骤中被洗掉。


  •   使用对结合的免疫球蛋白的 Fc 部分具有特异性的抗体来检测剩余的抗原特异性免疫球蛋白。这通常以同种型特异性方式进行,例如仅 IgG 检测。从更实际的角度来看,可以使用一步(图 2A)或两步检测设置(图 2B)。由于抗原特异性免疫球蛋白的丰度可能较低,因此更灵敏的两步检测可能更适合放大检测信号。


  图 2.抗原特异性免疫球蛋白 ELISA,使用 A)一步检测的直接ELISA 或 B)两步检测的  间接ELISA。


  抗原特异性免疫球蛋白检测的应用


  •   对疫苗、感染、自身抗原、过敏原等的免疫反应!


  •   杂交瘤筛选


  同型或亚类特异性免疫球蛋白


  典型的夹心测定设置可用于检测相同同种型(也称为类)或相同抗体亚类的抗体(图 1C、图 3)。为此,您需要一对特异于 Ig Fc 部分(抗体骨架)的匹配抗体对,以区分同种型或亚类。将捕获抗体包被到 ELISA 板后,样品中的 Ig 将被特定包被 mAb 捕获,然后在下一步中被检测抗体夹在中间。由于 Ig 同种型通常在血液样本中含量丰富,因此一步检测设置(图 3A)可能优于两步检测(图 3B),因为不需要信号放大。IgE 是一个例外,由于其在人体中的丰度较低,因此应使用两步 ELISA 进行分析。



  图 3.使用 A) 一步检测或 B) 两步检测,通过夹心 ELISA 检测总免疫球蛋白同种型或亚类。


  抗免疫球蛋白 ELISA 的应用


  •   量化样品中的总免疫球蛋白水平


  •   通过确定免疫球蛋白同种型和亚类揭示免疫反应的细节


  如何使用Ig ELISA



  图 4.抗原特异性 Ig ELISA 应用示例。在加强注射之前和之后使用 ELISA 测量破伤风类毒素 (TT) 特异性 Ig。在接种 Covaxis(一种包含 TT 的联合疫苗)加强剂量之前和之后两周,收集了来自四位不同捐赠者的血浆样本。将血浆样品稀释 10,000 倍(IgG、IgM)、1,000 倍(IgG1)或 100 倍(IgG2、IgG3、IgG4),并使用同种型或亚类特异性检测抗体检测 TT 特异性 Ig 的结合。

  

提示!


  如果您在同一块板上结合同种型检测和抗原特异性检测,请注意 ELISA 方案的差异。