酶联免疫试剂盒的工作原理全解析

  酶联免疫试剂盒(ELISA)是一种常用的分析生化检测，由Eva Engvall和Peter Perlmann于1971年首次描述。是一种固相类型的酶免疫测定(EIA)，使用酶联免疫技术针对待测蛋白质的抗体来检测液体样品中配体（通常是蛋白质）的存在。ELISA已被用作医学、植物病理学和生物技术的诊断工具，以及各个行业的质量控制检查。相关阅读：《什么是酶联免疫试剂盒》

  什么是酶联免疫技术？

  酶联免疫技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA），1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。

酶联免疫技术

  ELISA的类型

  ELISA可分为三种主要类型：夹心、间接和竞争。

  夹心ELISA

  首先，“捕获”抗体与孔结合。然后，添加样品后，仅“捕获”抗体识别的蛋白质。最后，使用第二检测抗体进行结合蛋白的检测。检测和捕获抗体也称为匹配抗体对或匹配对。最后，使用酶标二抗检测检测抗体。

  间接ELISA

  在这种类型的ELISA中，蛋白质样品通过吸收直接结合到孔中。然后，使用称为抗原的抗体检测样品中蛋白质的存在。在这种类型中，由于每个一抗中存在大量允许信号放大的表位，因此灵敏度增加。

  竞争性ELISA

  在这里，一抗的存在与样品一起产生，形成复合物。当复合物沉淀后，将二抗添加到孔中。仅当抗原未与其结合时，一抗才能被识别。因此，可见二抗与抗原竞争。

  酶联免疫试剂盒基本组成

  一个完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：

  1、已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；

  2、酶标记的抗原或抗体（结合物）；

  3、酶的底物；阴性对照品和阳性对照品（定性），参考标准品和控制血清（定量）；

  4、酶联物（结合物）及样本的稀释液；

  5、’洗涤液；酶反应终止液。

  酶联免疫试剂盒原理

  酶联免疫试剂盒（ELISA）是一种将抗原-抗体结合反应与酶催化反应相结合的免疫分析方法。该方法的基本原理是将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加入酶标记的二抗，形成酶标抗原-抗体复合物。当底物溶液加入到反应体系中时，底物在酶的催化下发生化学反应，产生颜色变化。通过检测颜色变化，可以确定是否存在待检测的抗原或抗体。

  酶联免疫试剂盒的应用与优势

  酶联免疫吸附测定(ELISA)是应用最广泛的免疫测定类型之一，比RIA更安全、更容易。ELISA涉及使用酶活性作为检测抗体-酶缀合物结合的手段。酶在其催化的反应和其识别的底物方面具有特异性，并受到其他分子对其活性的调节。因此，由于酶的特异性和酶催化产生的扩增现象，酶的使用可能是有利的。ELISA的检测类型有所不同，当酶标记产生有色产物时，通常采用分光光度法；当酶催化氧化还原化学反应时，通常采用电化学法。ELISA的主要缺点是酶活性依赖于物理和化学环境。

  酶联免疫试剂盒局限性和挑战

  在使用酶联免疫试剂盒进行免疫测定实验过程，难免会出现一些问题，比如假阳性。这里上海通蔚生物为各位盘点了一下。

  假阳性结果的可能原因包括：

  1、交叉反应：不同分子之间可能存在交叉反应，导致非特异性信号的产生，从而产生假阳性结果。

  2、样本污染：样本处理过程中的污染或者不洁净的工作环境可能会引入外部干扰物质，干扰实验结果的准确性。

  3、操作不当：操作过程中的技术不到位或者操作失误，如试剂的过量使用、温度控制不当等，都可能导致假阳性的产生。

  4、试剂盒质量：试剂盒的质量问题，如存储条件不当、过期等，可能影响试剂盒的稳定性和准确性，从而导致假阳性结果的出现。

  假阴性结果的可能原因包括：

  1、抗体交叉反应：ELISA试剂盒使用的抗体可能会与其他非目标分子结合，导致假阴性结果。

  2、固相抗体和酶标二抗的变构：固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构，使Fc段的补体C1q结合点暴露出来，使C1q成为一个中介物将二者交联起来，导致假阴性结果。

  3、外源性干扰因素：如标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等，都可能影响抗原与抗体的结合，导致假阴性结果。

  为了减少假阳性或假阴性结果的出现，可以采取以下措施：

  1、优化试剂盒和实验条件：选择质量可靠的试剂盒，并严格按照说明书操作，优化实验条件，降低假阳性或假阴性的风险。

  2、严格控制样本来源和处理过程：保证样本的纯净性和完整性，避免样本污染或者其他外部因素的干扰。

  3、增加质控步骤：在实验过程中增加质控步骤，监测实验的稳定性和准确性，及时发现问题并进行调整。

  4、合理选择阳性和阴性对照：选择适当的阳性和阴性对照，确保实验结果的可靠性和准确性。

  5、多方验证实验结果：如有条件，可以采用其他方法对实验结果进行验证，提高数据的可信度和可靠性。

  希望大家可以通过上述方法避免ELISA实验带来假阳性，假阴性温度，最大化提高实验的效率。

  未来展望

  自1590年Zacharias Janssen和Hans Janssen发现光学显微镜以来，实验室检查经历了重大演变。Eva Engvall和Peter Perlman于1971年开发的ELISA（酶联免疫吸附测定）方法标志着一个重要的里程碑在显微实验室测试中。该方法为疾病诊断、生物研究、医学等科学领域做出了重大贡献。在ELISA方法中，抗原、抗体和酶与底物之间的反应发生在孔微孔板内，并且可以通过分光光度法来测量结果。ELISA具有操作简单、灵敏度高、效率好等优点。然而，也存在一些挑战，例如抗体制备成本高以及假阳性/阴性结果的可能性。尽管如此，ELISA仍然是当今实验室检查中最常用的方法之一，在疾病诊断、健康监测和研究中有多种应用。随着技术的不断进步，预计未来ELISA方法将不断发展，为提高医疗质量和科学认识做出更大的贡献。