优化ELISA试剂盒：提高灵敏度的关键要素

  内容列表：

  ELISA 简介

  ELISA试剂盒中匹配的抗体对

  酶联免疫吸附测定样品

  ELISA 封闭和洗涤步骤

  如何提高ELISA灵敏度

  ELISA 简介

  酶联免疫吸附测定 ( ELISA ) 是现有的最灵敏和可重复性最高的技术之一。这些测定快速、易于执行且易于自动化。与任何检测一样，ELISA 的重现性和可靠性取决于正确的技术和对细节的关注。

  ELISA技术分为：

  直接 ELISA，其中抗原固定在 ELISA 板上，一抗带有标记（图 1 A）

  间接 ELISA，其中抗原固定在 ELISA 板上，二抗带有标记（图 1 B）

  三明治 ELISA，其中两个一抗（用于捕获和检测）嵌入抗原，形成“三明治”，然后复合物被二抗标记抗体识别（图 1 C）。

  图 1. ELISA 格式的类型：A) 直接、B) 间接和 C) 夹心 ELISA。

  ELISA 试剂盒中匹配的抗体对

  匹配对是指已知可识别同一蛋白质抗原上不同表位的抗体组，因此它们可以一起用于夹心 ELISA 中捕获和检测单个抗原。ELISA 测定中使用的抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或两者的组合。

  单克隆抗体可用于所有类型 ELISA 中所有含抗体的步骤。它们通常在夹心 ELISA 中成组使用，但也可与多克隆抗体结合用于捕获或检测，以增强信号或提供更大的从复杂溶液中捕获抗原的机会。

  由于多克隆抗体溶液中抗体的异质性和表位的广泛代表性，多克隆抗体可以成为检测抗原的强大工具，通常比单克隆抗体产生更高的信号水平。然而，多克隆抗体更有可能与密切相关的蛋白质共享一个或多个表位，从而导致更高的非特异性信号。减少该问题的一种方法是使用亲和纯化或交叉吸收的多克隆抗体。为了提高测定灵敏度，可以将 ELISA 的检测方法从直接检测转换为使用多克隆抗体的间接检测。

  酶联免疫吸附测定样品

  ELISA 可以测试多种样品，测定条件的选择将取决于样品的复杂性和预期存在的抗原量。

  重要的是要结合已知标准对所有样品进行一式两份或三次测试，以确保结果和定量的准确性。

  最好测试样品的几种稀释度，以确保最终结果落在标准曲线的线性部分内。高度浓缩的样品可能会低估浓度，而高度稀释的样品可能会高估浓度。

  ELISA 封闭和洗涤步骤

  通常需要进行封闭，以防止检测抗体与多孔板表面本身的非特异性结合。当板完全封闭时，由于非特异性信号将减少，因此测定灵敏度将增强。

  彻底的清洗程序对于获得可靠的 ELISA 结果至关重要。重要的是通过轻轻地将吸液头放入底部来完全吸出所有孔中的液体。避免划伤孔的内部。清洗完成后，建议将板倒置并在吸水纸上擦干。

  如何提搞elisa试剂盒灵敏度

  捕获抗体浓度

  在包被缓冲液中制备不同浓度的捕获抗体。

  阻塞缓冲区

  准备不同的封闭液。如果封闭液未预先配制（即，它是单一蛋白质，例如 BSA），请尝试不同浓度的蛋白质。

  标准稀释液

  尽量使标准稀释剂与样品基质尽可能匹配。

  如果基质本身不能精确复制，则测试不同的标准稀释溶液并检查样品的标准曲线和稀释线性。可能需要选择不同的稀释剂。

  如果样品的线性度较差，则样品基质和标准稀释剂之间可能存在不平衡。在这种情况下，应进行加标回收或稀释线性实验。

  样品浓度

  准备不同浓度的样品，同时牢记底物的检测限。为了确认生物样品基质不会掩盖或增强信号，应进行加标和回收以及稀释线性实验。

  检测抗体浓度

  制备不同浓度的检测抗体。

  酶结合物浓度

  根据底物描述的 ELISA 试剂盒范围制备不同浓度的酶缀合物。

  信号检测

1.   根据样品中抗原的量以及用读板器检测抗原的能力来选择底物。
2.   如果可以清楚地检测到抗原，则底物是合适的。
3.   如果抗原低于检测阈值，则选择更灵敏的底物。