扩增子测序：成功建立扩增子测序5种技巧

  扩增子测序是一种目标基因测序方法，它针对特定基因组区域进行PCR扩增和测序。什么是扩增子测序？它有什么用途？上海通蔚生物在下文详细为大家介绍，使大家了解更多生物知识应用于科研。

  什么是扩增子测序？

  扩增子测序是一种靶向测序方法，使用寡核苷酸引物扩增基因组的特定区域。这种方法为研究人员提供了机会，使他们能够仅获取他们最关心的基因组代码部分的遗传信息。扩增子测序采用聚合酶链式反应(PCR)，这是分子生物学中最广泛使用的技术之一。PCR包括在短时间内创建特定核酸样本的多个副本（这一过程称为扩增）。

  扩增子测序是研究复杂自然和人工环境中的微生物多样性、靶向病原体测序以追踪传播途径和研究病原体进化以及变异识别的完美工具。

  扩增子测序有何用途？

  扩增子测序广泛用于识别各种病原体并追踪其进化和传播模式。该技术在COVID-19大流行期间对追踪和控制SARSCoV-2病毒的传播做出了重大贡献。扩增子还广泛应用于各种分子生物学技术中，如DNA测序、基因组学、环境微生物学等。通过扩增特定的DNA序列，可以快速而精确地检测和鉴定目标生物体或基因，从而在研究和诊断中起到重要的作用。

  什么是16SrRNA测序？

  16SrRNA测序是最流行的扩增子测序方法之一。它通常用于识别和比较给定样本中细菌和古细菌的分类组成。这种强大且经济高效的非培养方法使科学家有机会识别使用更传统的湿式实验室技术时可能会被忽视的菌株。原核生物16SrRNA基因长约1500bp，包含9个可变区(V1-V2)，这些可变区由保守区隔开。对16SrRNA基因的这些可变区进行测序被广泛用于复杂微生物群落的深度分类（在属或有时甚至在物种级别）。此外，16SrRNA测序受益于扩增子测序的固有优势，包括能够在一次测序运行中组合多个样本（多重）。

  成功建立扩增子测序实验的五个技巧：

  1.核酸样本

  使用新鲜、高质量的核酸模板。鉴于基于PCR的方法（包括扩增子测序）的分辨率非常高（这通常被认为是一种优势），使用降解或受污染的模板可能会导致不确定或有争议的结果。

  2.主混合物和高标准引物设计

  使用市售的主混合物，而不要单独混合所有成分[DNA聚合酶、核苷酸(dNTP)、特定离子(MgCl2)]。这有助于最大限度地减少人为错误以及样本间差异，并提高一致性。

  3.污染

  扩增子测序的高分辨率意味着即使输入模板量非常小，也会导致分析样本中不存在的污染序列的扩增。这就是为什么PCR区域的所有表面都应定期用5%漂白剂溶液或紫外线消毒进行消毒。如果可能的话，请在无模板区域（最好是单独的房间）准备PCR反应，然后在另一个房间添加核酸样本。

  4.控制

  最大限度地减少污染可能性的最有效方法之一是在整个实验过程中有效使用控制。

  a、阴性或无模板对照(NTC)对于确认没有交叉污染尤为重要。NTC包括除核酸模板之外的所有试剂；通常用等量的无核酸酶水代替模板。

  b、阳性对照包含已知核酸序列和用于检测该序列的引物。该对照用于识别假阴性结果。如果阳性对照产生信号，则表示PCR中的所有试剂均正常工作。阳性对照对于研究条形码错配的影响特别有用。

  5.条形码不匹配

  由于现代NGS平台会生成大量数据，因此通常会将多个文库合并（或多路复用）并在一次运行中进行测序，以降低测序成本。为了能够在测序后识别每个读取，在文库制备步骤中，使用样本特定的DNA索引标记所有DNA片段（或进行条形码编码）。这种样本多路复用有时会导致索引错误分配，原因是各种机制，包括索引跳跃或条形码污染。因此，测序读取可能会分配给错误的索引（从而分配给错误的样本），并将从下游生物信息学分析中丢弃。为了最大限度地降低条形码错误分配的风险，建议仔细选择多路复用策略，以使用独特的双索引(UDI)适配器或索引引物。

  扩增子测序是一种高通量靶向测序方法，使研究人员有机会在一次运行中对多达数千个感兴趣的基因区域进行测序。与非靶向方法相比，这种高度针对性的方法具有成本效益，并且周转时间更短。