ELISA实验原理探秘与步骤指南

  了解ELISA实验原理及步骤有助于科研人员准确、高效地进行实验设计、操作与结果分析，提升科研能力。今天，上海通蔚生物从ELISA实验原理及步骤出发来讲一讲，有助于大家对ELISA实验有全面了解。

  ELISA实验原理

  酶联免疫吸附实验，或称ELISA，是一种常用的血清学检测方式，接下来这篇文章为大家详细介绍其工作原理，请拿好小板凳来做笔记。

  ELISA血清学检测法通常是在多孔微量板中进行，这样可以很方便的进行血清的稀释和检测。在进行检测前，先用目标抗原包被多孔板的每个孔。对于商业化的检测，制造商会把这个步骤先做好。

  开始检测时，我们会在每个孔中加入稀释过的患者血清，如果病人血清中有相应的抗体存在，它们会与固定在孔底的抗原结合。接着，用缓冲液冲洗出未和目标抗原结合的抗体。然后，加入含有动物抗体的溶液（注；此动物抗体是能够抗人体的抗体的）。这第二种抗体（既动物抗体）上共价结合了一个酶。

  再次清洗这些孔，这次是为了出去未结合的没标记的抗体。最后，加入显色溶液，这样溶液含有一种被酶催化显示的底物。底物与第二种抗体上的酶相互作用，可以使溶液呈现明显颜色。因着不同浓度的目标抗体存在，孔槽溶液会产生不同程度的颜色变化。这样的颜色变化，可以通过肉眼观察和仪器定量读取每个孔中的特定抗体的显色结果。血清浓度随着稀释而降低，能够和抗体产生反应的抗体浓度也因而随之下降。

  所以颜色变化也因而由浓变淡。能出现显色反应的最高稀释倍数就是所测样品的效价。

  ELISA实验步骤

  在开始做ELISA实验之前，我们先理一下需要哪些准备。需要准备包括：

  实验用品：

  药品：稀释液、酶标二抗、底物、阳性血清、阴性血清、终止液

  器材：抗原板、稀释版、待检血清、加样槽、移液枪、加样仪、酶标仪、恒温箱

  在做实验时候，我们要准备一个实验本，在做实验之前把这次实验步骤理顺，然后根据我们相应的实验所反馈的结果要实时的登记在我们实验记录本上面。接下来给大家详细说下实验步骤：

  步骤一：首先我们要根据我们的血清量，合理的吸取相应的稀释液的量加入我们的稀释板里面。

  我们用多道移液枪到我们稀释板里面（调到适当的量程）根据我们反应要求的倍数进行稀释，用排枪将稀释液吸入板中（注：在吸入过程要保证排枪的枪头里面的稀释液处于同一水平）。

  然后，在使用微量移液枪调取我们所需要的量程，按顺序吸取适量的待检测血清，加入稀释板的稀释液中。依次类推，将所有的待检血清依次加入对应的稀释板中。

  加入完后，最后加入阳性血清和阴性血清。使用排枪将加入好的血清和稀释液混匀过后对比加入抗原板中，将加入完抗原板用密封袋密封后放入37度的恒温箱中，孵育40分钟（注：不是所有孵育时间都是40分钟，可以根据说明书进行孵育），待40分钟孵育完毕后，将抗原板取出，将抗原板内稀释液倒掉，然后用加样仪加入洗涤液，按照使用要求，将抗原板洗涤3-4次。每次加入洗涤液之后，都要将洗涤液倒出，然后在加入洗涤液，依次类推，当第四次加入完毕后，将板内洗涤液在书本或者桌布上面进行相对的拍干（注：板子相对拍干过后与下一次的试剂加入的间隔时间不易太久）。

  步骤二：加入酶标二抗。用拍枪版将酶标二抗加入抗原板中，加入完毕后，用密封袋密封过后放入37度恒温箱中孵育40分钟。孵育完毕后，将抗原板拿出倒掉酶标二抗，然后加入洗涤液，将抗原板洗涤3-4次。倒掉过后拍干。

  步骤三：加入底物（注意：底物一般为避光试剂，在加热过程应保证整个过程是快速的）。将底物加入抗原板中，加入完毕后，直接放入37度恒温箱中进行孵育，此过程不需要密封袋进行密封。将底物拿出，底物的孵育时间一般为10-15分钟。

  步骤四：加入终止液。加入完后，可以用酶标仪读数，一般要将数据导入U盘进行整理。

  上述为大家整理了elisa实验原理及步骤，大家可以作为参考。大家在做elisa实验时候可以结合自己的说明书进行。如果您还有疑问，可以在线咨询我。

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