elisa实验原理全解析：酶联免疫吸附试验的工作原理及其重要性

  酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 简称。是免疫学检测应用比较广的技术。ELISA具有更高的灵敏度和专一性，可以检测非常低浓度的生物分子，如蛋白质、抗体和细胞因子等，并可区分相似的分子。这使得ELISA 在诊断疾病、监测病情、检测病原体等方面更加具有可信度和精确度。下面通蔚生物给大家详细介绍下ELISA实验原理。

  

  ELISA实验原理

  

  Elisa为免疫学反应为基础，在ELISA技术中，将抗原固定在固相表面上，然后与抗体结合形成抗原抗体键复合物，其中抗原抗体复合物与酶结合。由于酶与底物之间的反应，会形成颜色变化形式的检测信号。在ELISA实验应用中，具体方法有很多种，比如常见的用于检测抗体包括直接法、间接法、竞争法和夹心法等。

  

  ELISA操作步骤

  

  有几种不同的 ELISA 测定技术，但它们都利用在 96 孔聚苯乙烯板固相载体。这些孔经过化学处理，使其具有“粘性”，从而增加了蛋白质吸附到板表面的能力。

  

  ELISA 测定依赖于酶结合标记和底物之间的酶促反应来产生比色、化学发光或荧光产物。然后通过分光光度计或荧光计检测和定量这些产物，提供有关样品中目标蛋白浓度的信息。

  

  ELISA 由多个步骤组成。其中许多步骤是封闭和洗涤步骤，以防止非特异性结合。当蛋白质通过脱靶相互作用相互吸附或吸附到 ELISA 板的固相表面时，就会发生非特异性结合。不同方法之间的确切 ELISA 步骤略有不同，但这里我们将重点关注夹心 ELISA作为示例。

  

  夹心ELISA（酶联免疫吸附分析），该实验基本原理是抗体-抗原之间的特异性结合反应，通过夹心模式将抗体固定在酶标板孔中，再加入样本和酶标二抗，最后通过底物显色反应读取光密度值，从而计算出抗原或抗体的浓度。

  

  实验器材：酶标板、抗体、样本、酶标二抗、底物等

  

  实验步骤步骤：本实验步骤分为九个步骤

  

  夹心 ELISA 步骤：

  

  第 1 步：捕获蛋白的固定化

  

  在夹心 ELISA 中，捕获蛋白是抗体，目标是抗原。因此，ELISA 的第一个步骤是将捕获抗体固定到板上。许多 ELISA 试剂盒都带有预先固定的捕获蛋白。

  

  第 2 步：洗掉孔表面任何未吸附的捕获蛋白

  

  使用去污剂的洗涤步骤可减少蛋白质之间的脱靶疏水相互作用，并从板上去除未结合的捕获蛋白质。

  

  第 3 步：封闭板上任何未结合的位点

  

  蛋白质之间的疏水相互作用是由电荷或疏水性介导的。这意味着可以通过封闭和清洗步骤在一定程度上减轻它们。

  

  将蛋白质添加到板中，蛋白质吸附到板表面的开放位点。牛血清白蛋白 (BSA)、酪蛋白或抑肽酶等蛋白质通常用于 ELISA 测定中的封闭。

  

  这些蛋白质将吸附到板上，从而防止目标蛋白质随后访问这些位点。以这种方式降低非特异性结合的发生率会导致背景噪音降低。

  

  第 4 步：洗掉孔中所有未吸附的封闭蛋白

  

  第二个洗涤步骤去除任何未结合的封闭蛋白。

  

  第 5 步：与样品（血清、尿液、唾液或加标研究溶液）一起孵育

  

  在这一步中，抗体和抗原之间发生特异性识别。在夹心 ELISA 中，抗体被吸附到板上，并与样品液中的目标抗原结合。这需要一个孵育步骤以使结合动力学达到平衡。

  

  第6步：洗掉孵化液

  

  这是至关重要的洗涤步骤，通常需要多次洗涤以确保洗掉任何未结合的抗原。在此步骤之后，孔中唯一应保留的抗原是那些附着于捕获抗体的抗原。

  

  第7步：与检测抗体一起孵育

  

  ELISA 中的检测抗体与某种标记物结合，例如荧光团（用于荧光测定）或酶（用于比色检测或化学发光）。检测抗体“识别”目标抗原上与捕获抗体不同的表位。因此，三明治 ELISA 测定产生捕获抗体-抗原-检测抗体的“三明治”。

  

  第8步：洗掉未结合的检测抗体

  

  步骤9：应用底物进行化学比色或化学发光反应，或应用入射光进行荧光反应，并对信号进行定量

  

  根据所使用的 ELISA 方法，荧光量、发光量或颜色强度表明从样品中捕获了多少目标抗原。

  

  Elisa实验应用

  

  ELISA 测试有多种应用，例如食品工业、疫苗开发、免疫学、诊断、药物监测、制药工业和移植。

  

   食品工业

  

  ELISA 在食品工业中发挥着重要作用。它是识别食物过敏原（例如牛奶、花生、核桃、杏仁和鸡蛋中的过敏原）的主要平台。ELISA 还可用于证实食品的真实性。该技术对于避免冒充替代可能造成的经济损失有很大帮助。

  

  疫苗开发

  

   疫苗开发是 ELISA 的一个非常重要的应用，它是 ELISA 过程的一个很好的候选者。可以测试来自免疫动物或人类模型的血清样本，以检测是否存在针对有意注射到宿主体内的某些类型抗原的抗体。

  

  免疫学

  

  身体的防御者，免疫系统，可以以细胞或体液（先天或适应性）模式运作。测量和监测免疫反应的变化是了解免疫疾病的基础。各种研究已证明 ELISA 是此类测量和监测的金标准方法，该方法快速且经济高效。

  

  体液免疫

  

  ELISA 在研究免疫系统对不同类别感染的体液反应方面也显示出巨大的潜力。体液免疫反应涉及体液中存在的物质（抗体和其他成分）。

  

  诊断

  

  在诊断领域，ELISA 已被证明是一个在全球范围内应用的强大平台，可用于检测人类和动物的多种疾病类型。市场上有许多不同的商业 ELISA 试剂盒可用于检测 HIV、流感、登革热、埃博拉、恰加斯病、利什曼病、莱姆病、西尼罗河病毒等。即使在植物病理学中，ELISA 技术也越来越受到关注。ELISA 成功克服了以前在植物诊断中进行的血清学分析的缺点

  

  怀孕测试

  

  许多不同的生物分子实体，包括人绒毛膜促性腺激素（hCG）、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌三醇（E3）和促甲状腺激素（TSH）可以因怀孕而表达。ELISA 可以在妊娠早期从母体血液、唾液或尿液中检测到其中一些蛋白质。HCG 是常见的激素之一，可在受精后第一个月通过 ELISA 检测到。另一种与妊娠相关的生物分子是雌三醇 (E3)，可在妊娠第 6 周时通过唾液中的 ELISA 检测到。

  

  癌症检测

  

  高灵敏度的癌症检测提供了早期诊断，这对于患者的生存至关重要。然而，癌症生物标志物是作为目标分析物最具挑战性的生物分子实体之一。ELISA 技术的进步有望应用于癌症生物标志物的检测。

  

  ELISA实验的优缺点

  

  与其他免疫测定技术相比，ELISA 有许多优点。elisa具有高灵敏度和特异性。与放射免疫分析 (RIA) 测试等其他技术相比，ELISA 还提供更高的准确性。

  

  ELISA 测定通常采用 96 孔微孔板。主要优点是一次运行可进行 96 次测定，通常在 3 小时内即可提供结果。这既快速又具有成本效益。

  

  ELISA 程序使用简单。由于抗体和抗原之间的反应，它具有出色的灵敏度和高特异性。ELISA 还非常高效，因为无需任何复杂的样品预处理即可轻松进行同步分析。由于避免使用放射性物质和大量有机溶剂，ELISA 测试既环保又安全。

  

  ELISA实验所有方法的缺点很明显：

  

  1、重复性不好；

  

  2、收自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性；

  

  3、不论仪器和手工操作，干扰因素较多。影响最大的是温度和时间。

  

  上述文章为大家介绍ELISA实验的原理，通过了解ELISA实验原理可以帮助我们更好的认识和提高ELISA实验操作，为科研提供有利的技术支持。

  

  最后

  

  上海通蔚ELISA试剂盒采用经过精心设计和筛选的抗原抗体对，保证了实验的特异性和灵敏度，使您能够准确地捕捉目标分子。

  

  上海通蔚生物始终坚持以客户为中心，提供全面的技术支持和售后服务。我们的专业团队将随时为您解答实验中遇到的问题，确保您的研究顺利进行。