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ELISA(酶联免疫吸附测定)中的检测方法

发布时间:2024-01-29     发布作者:上海通蔚生物

  ELISA检测抗体所标记的酶(通常是 HRP AP)决定了 ELISA 实验可用的检测方法。最常用的三种检测方法是比色法、荧光法和化学发光法,根据实验所需的灵敏度、定量的动态范围、信噪比等选择检测方法。


 ELISA检测方法


  比色测定

 

  ELISA实验最常用的检测方法是比色法。通常,辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP) 偶联抗体用于与底物(例如TMB )进行显色反应。这是通过测量吸光度来检测的,并通过创建校准曲线或比较样品的颜色来量化。

 

  化学发光分析

 

  第二种检测方法是利用过氧化物酶标记的检测抗体进行化学发光反应。在此方法中,将基于鲁米诺的增强剂溶液与底物一起添加以产生化学发光反应,并使用光度计进行检测。当需要宽动态范围时,使用化学发光检测。

 

  荧光测定

 

  第三种检测方法使用带有荧光底物的过氧化物酶标记的检测抗体。该方法可以产生更高的信号和更宽的动态范围。然而,荧光底物的半衰期通常比比色底物短,并且染料的漂白可能是一个问题。

 

  使用黑色多孔板进行荧光测定,以尽量减少背景。用荧光计检测从酶促反应获得的荧光信号。

 

  如何确保ELISA实验的获得理想的结果

 

  起始材料是关键。为您的 ELISA 选择合适的实验室设备非常重要。就像微孔板设计这样简单的事情都会影响收集的数据。由于测量的是光作为反应终点,因此选择透明板进行比色,选择黑色板进行荧光检测,选择白色板进行发光 ELISA 检测。

 

  例如,在测量荧光测定时,使用避免孔之间光散射的材料非常重要。使用专为荧光测定设计的板还可以避免塑料发出的荧光。科研人员应该意识到某些生物体液会显示背景荧光;适当的稀释步骤可以帮助防止这种干扰。

 

  孔内充分混合也是一个优先事项。考虑在您的实验室设置中使用微孔板摇床或带有集成摇床的读板器。优化您的工作流程还可以创建良好的数据:通过防止分析物蒸发并确保正确移液来最大限度地减少边缘效应,这意味着微孔板中的所有孔都能提供良好的无偏差结果。

 

  与所有实验室方案一样,关注测定设计并了解所研究的分析物是 ELISA 成功的关键。