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elisa实验:认识比色测定、发光和荧光的方法

发布时间:2024-01-24     发布作者:上海通蔚生物

  ELISA最初是为了取代放射免疫测定(RIA)中常用的放射性碘标签而开发的。它们通常包含96孔板形式,孔上结合有抗原(直接和间接ELISA)或抗体(夹心和竞争性ELISA)。通过一系列封闭清洗和检测步骤,测量待测生物样品中分析物的浓度,通常与已知抗原浓度的系列或标准稀释曲线进行比较。关于elisa方法,可以参考:《ELISA是什么检测方法?带您深入了解ELISA


elisa检测方法

 

  ELISA中常用三种不同的检测系统:比色测定、发光和荧光。这些都依赖于一种显示反应介质中可量化变化的方法,通常是显色,这取决于分析物的浓度。在ELISA过程结束时,添加与酶联报告基因发生反应的酶底物试剂,从而发生颜色变化。

 

  与抗体结合的最常见报告基因是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)和β-D-半乳糖苷酶(BG)。这三种物质在标准测定条件下都很稳定、呈惰性,并且相对易于使用。

 

  HRP是一种小分子,因此,当它与测定抗体结合时,不会引起空间位阻并干扰抗原结合。然而,它会受到某些常见防腐剂(例如叠氮化钠)的影响,并且还可能受到生物样品中内源过氧化物酶活性的影响。确保ELISA期间进行充分的洗涤步骤通常可以减轻干扰。

 

  AP是较大的分子,因此必须注意避免空间位阻。检测还需要更严格的条件,因此应使用AP特异性检测缓冲液。

 

  BG是一种更大的分子,但更适合疏水性膜表面(例如斑点印迹),因为用作润湿剂的酒精可以增强检测。

 

  ELISA检测方法

 

  ELISA测定通过测量报告分子对作为测定最后步骤添加的酶底物的作用来读取。底物的选择取决于测定形式。例如,不溶性的最终结果最适合膜结合反应,例如斑点印迹。

 

  其他考虑因素包括预期浓度范围、测定时间、灵敏度和使用的检测装置。例如,在预期浓度范围较广的情况下,使用反应超过1530分钟的酶底物可能会产生最佳结果。分析物浓度极低的灵敏测定需要快速作用的底物。具有定时终点的测定包括在读数之前停止并稳定反应的终止步骤。还可以通过在一段时间内进行多次测量来监控转化率,以显示动力学分析。

 

  比色测定检测显示可以在可见光谱中定量的颜色变化,其中光密度随浓度变化。在读取平板之前,持续孵育以使所有孔均等发育非常重要。

 

  荧光免疫测定使用在某些光波长激发时发出荧光的酶底物。它们通常与比色测定一样灵敏,但不受较高分析物浓度的限制。它们可以发出更强烈的光,而不会产生压倒性的信号检测,从而提供准确的读数。

 

  ELISA中的发光检测依赖于生物发光(其中光由生物底物产生)或化学发光(其中化学反应后释放光子)。由于发光技术与信号倍增和放大的兼容性,因此被认为是ELISA检测最灵敏的方法。

 

  上述内容为大家介绍ELISA检测方法,大家可以根据自身的实验来对照自己需要的检测方法,从而提高实验结果的读数。