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elisa实验要点:如何准备 ELISA 样品

发布时间:2024-01-17     发布作者:上海通蔚生物

  ELISA是一种对于帮助定量给定样品中存在的靶标数量非常重要的程序。正确准备样品至关重要,这对于确定ELISA 实验是否成功至关重要。

 

  样品准备好后,可以将其等分并冷冻以进行长期储存。建议储存条件如下:2-8°C 5 天,-20°C 6 个月,-80°C 2 年。还建议从存储中取出样品时避免重复冻融循环,这就是为什么最好以较小的等分试样存储样品。

 

  有许多不同的样品可用于ELISA 方法。下面将讨论一些最常见的样品,并将提供有关如何最好地准备每个样品的一般说明。但是,我们建议遵循每个试剂盒提供的具体说明,因为一个试剂盒与另一个试剂盒的方案可能略有不同。

 

  不同的样品类型

 

  一、血液样本

 

  血清:不含任何血细胞或凝血因子;它就像没有纤维蛋白原的血浆。

 

  (a)使用血清分离管收集全血样本,方法是将其在室温下静置 2 小时或在 2-8°C 之间过夜。需要注意的是,这是一种自然的血液凝固方法。此外,如果温度降低,凝血过程也会减慢。

 

  (b)、然后将样品以 1000 x g 离心 20 分钟。

 

  (c)、将上清液转移至干净的管中。

 

  (d)、可以立即分析,也可以冷冻(-20°C -80°C)以供以后使用。

 

  血浆(EDTA、柠檬酸、肝素):这些样品需要抗凝,这取决于所使用的目标分析物。

 

  (a)、将血浆收集到含有所需抗凝剂的试管中并轻轻混合。

 

  (b)、收集样品后 30 分钟内将样品在 2-8°C 下以 1000 xg 离心 15 分钟。

 

  (c)、将上清液转移至干净的管中。

 

  (d)、可以立即分析,也可以冷冻(-20°C -80°C)以供以后使用。

 

  组织样本

 

  几乎所有的组织样本都被加工成组织匀浆。所使用的方案很大程度上取决于将用作样本的提取组织。可能需要包括额外的蛋白质抑制剂以最小化或防止分析物的任何进一步降解。

 

  (a)、必须使用干净的工具解剖组织,然后必须将其快速放置在冰上以防止蛋白酶发生任何潜在的降解。

 

  (b)、使用预冷却的 0.01M PBS 缓冲液(pH 7.4)清洗组织,这应该去除可能存在的任何残留血液。

 

  (C)、然后在均质化之前称量组织。

 

  (d)、将处理后的匀浆以 5000 xg 离心 5 分钟。

 

  (e)、将上清液转移至干净的管中。

 

  (F)可以立即分析,也可以冷冻(-20°C -80°C)以供以后使用。

 

  已发现一些组织样本显示假阳性结果,这是由于内源生物素与亲和素和链霉亲和素相互作用。这些组织的包括肾、肝、胰腺和脑组织。

 

  细胞样本

 

  细胞裂解物:首先需要裂解细胞,以便将其用于ELISA 分析。裂解步骤可以是使用 Triton X-100、脱氧胆酸钠、RIPASDSDTT 和尿素等试剂的化学过程,也可以是物理过程,例如使用重复冻融循环或超声处理。一般来说,物理程序是更好的选择,因为使用化学品可能会对ELISA 结果产生下游影响。

 

  (a)、使用胰蛋白酶溶液将贴壁细胞分离成悬浮液,然后将其离心,并将上清液收集到干净的管中。可以将已经悬浮的细胞离心并收集上清液。

 

  (b)、将细胞加入预冷的 PBS 中并洗涤 3 次。

 

  (c)、然后使用化学或物理方法裂解细胞。例如:可添加0.5ml RIPA裂解缓冲液,超声四次或冻融样品四次。

 

  (d)、以 1500 xg 离心 10 分钟,以去除可能存在的细胞碎片。

 

  (e)、将上清液转移至干净的管中。

 

  (f)、可以立即分析,也可以冷冻(-20°C -80°C)以供以后使用。

 

  (g)、细胞培养上清液:当研究分泌蛋白作为目标分析物时,强烈推荐这种样品类型。

 

  (h)、1000 xg 离心 20 分钟,这将去除可能存在的任何沉淀物。

 

  (l)、将上清液转移至干净的管中。

 

  (j)可以立即分析,也可以冷冻(-20°C -80°C)以供以后使用。

 

   唾液、牛奶和尿液样本

 

  这些样本变得越来越受欢迎,因为与血液样本相比,它们的侵入采集程序要少得多。它们经常用于检测大量抗微生物剂、分泌的分析物和许多其他生物酶。

 

  (a)、样品收集在无菌离心管中。

 

  (b)、然后在 2-8°C 下以 10,000 xg 离心 2 分钟或以 2000-3000 rpm 离心 20 分钟。

 

  (c)、’将上清液转移至干净的管中。

 

  (d)、可以立即分析,也可以冷冻(-20°C -80°C)以供以后使用。

 

  痰标本

 

  痰可以被描述为主要存在于呼吸道中的粘液和唾液的混合物。通常通过咳嗽从肺部排出。痰中可能存在许多令人特别感兴趣的病原菌。

 

  (a)、对痰的粘稠部分进行称重。

 

  (b)、称取的痰液中加入等量的0.1% DTT(具有溶解痰液的作用),并在35℃下混合5分钟。

 

  (c)、将等量的 PBS 添加到混合物中(1/2 稀释),继续混合 15-20 分钟。

 

  (d)、使用金属丝网过滤混合物。

 

  (e)、1500 rpm 离心 10 分钟。

 

  (f)、’将上清液转移至干净的管中。

 

  (g)、可以立即分析,也可以冷冻(-20°C -80°C)以供以后使用。

 

  脑脊液、腹水和支气管肺泡灌洗液 (BALF) 样本

 

  (a)、收集样品后,以 1,2000 rpm 离心 20 分钟。

 

  (b)、检查确保没有沉淀,如果有沉淀需要重新离心。

 

  (c)、将上清液转移至干净的管中。

 

  (d)、’可以立即分析,也可以冷冻(-20°C -80°C)以供以后使用。

 

  精液样本

 

  (a)、精液样本应收集在无菌容器中。

 

  (b)、将容器放入室温或 37°C 的水浴中。这将使纤溶酶使精液变稀并液化。

 

  (c)、将液化精液以4000rpm离心10分钟,以分离精浆。

 

  (d)、将上清液转移至干净的管中。

 

  (e)、可以立即分析,也可以冷冻(-20°C -80°C)以供以后使用。

 

  粪便样本

 

  (a)、收集超过 50 毫克的干粪便样本。值得注意的是,稀释的粪便样本更难处理,并且更难以检测,因为准确性降低。

 

  (b)、使用 PBS 将粪便样本清洗 3 次。

 

  (c)、离心步骤后,用 PBS 重悬(1g 粪便与 9ml PBS 的比例)。可以使用超声波粉碎溶液。

 

  (d)、5000 xg 离心 10 分钟。

 

  (f)、将上清液转移至干净的管中。

 

  (g)、可以立即分析,也可以冷冻(-20°C -80°C)以供以后使用。