细胞传代：贴壁细胞和悬浮细胞的实用指南

如果将细胞连续培养在同一个容器中，培养密度会逐渐增大，造成细胞衰老、细胞死亡。为了防止这种情况，将少量细胞移植到单独的容器中，这个过程称为“传代”。

传代程序根据细胞的性质而略有不同，因此请务必检查适合您所处理的细胞的方法。在本文中，我们将解释三种细胞的传代程序：贴壁细胞和悬浮细胞。

贴壁细胞传代

贴壁细胞在体外生长，直到培养容器表面被细胞覆盖或培养基中的营养物质耗尽。最好在细胞生长达到完全汇合之前进行传代。

所需设备和试剂：

1.预热至37°C的完全培养基

2.70%乙醇

3.不含钙镁离子的PBS(-)

4.0.25%胰蛋白酶溶液（含或不含EDTA）

5.胰蛋白酶抑制剂（可选）

6.台盼蓝

7.培养皿/培养瓶和标签

8.倒置显微镜

9.离心机（可选，用于收集细胞）

10.血细胞计数器

11.移液器

贴壁细胞传代方法：

以下是以0.25%胰蛋白酶为例的贴壁细胞传代步骤：

1.观察细胞状态：使用倒置显微镜观察细胞形态和汇合度。

2.移除旧培养基：小心吸出培养皿或培养瓶中的培养基。

3.清洗细胞：用不含钙镁离子的PBS(-)清洗细胞，去除残留的血清，以避免抑制胰蛋白酶活性。（根据细胞类型，此步骤可省略）

4.加入胰蛋白酶溶液：加入适量的0.25%胰蛋白酶溶液（含或不含EDTA，根据细胞类型决定），确保覆盖细胞表面。

5.消化细胞：将培养容器置于37°C孵育器中消化，根据细胞类型调整消化时间，通常为1-5分钟，并密切观察细胞形态变化，当细胞变圆并开始脱离瓶底时即可终止消化。

6.终止消化：加入含有血清的完全培养基或胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶的消化作用。

7.制备细胞悬液：用吸管轻轻吹打细胞，使细胞完全脱离瓶底并形成均匀的细胞悬液。

8.计数细胞：使用血细胞计数器和台盼蓝染色进行细胞计数和活力检测。

9.稀释和接种：根据所需的细胞密度，用新鲜的完全培养基稀释细胞悬液，并将细胞悬液接种到新的培养容器中。

10.培养细胞：将新的培养容器放入37°C、5%CO2的孵育器中进行培养。

贴壁细胞传代技巧

执行此操作时需要记住几点。首先，根据生长阶段，某些细胞系可能与表面的附着较弱，容易脱落。经常检查培养容器内部的状况，注意不要过早地分离细胞。

在步骤3中，用PBS(-)冲洗细胞表面，去除培养基中的血清。这很重要，因为胰蛋白酶在血清存在下不活跃。

当使用胰蛋白酶/EDTA对细胞进行处理时，请以分离细胞所需的最短时间进行处理。长时间接触可能会损害细胞表面受体。还可以使用非酶细胞分离剂（例如胰蛋白酶）来分离细胞。建议根据需要使用，例如当您想在温和的条件下剥皮时。

当将细胞接种到新的培养容器中时，必须用血清中和胰蛋白酶以使细胞粘附。除了使用血清外，还可以使用胰蛋白酶抑制剂（例如来自大豆的抑制剂）来中和胰蛋白酶。在这种情况下，首先向要中和的悬浮液中添加等体积的胰蛋白酶抑制剂（浓度为1mg/mL）。然后将添加的溶液离心，弃去上清液，并将细胞重新悬浮在新鲜培养基中。此程序在无血清培养基中培养时特别有效。

如果没有二氧化碳培养箱，则用经过0.2µm过滤器消毒的空气中的5%二氧化碳交换气体1-2分钟。

如果细胞密度不够，则以150×g离心5分钟，并用少量培养基重新悬浮。

悬浮细胞传代

悬浮细胞通常来源于血细胞或可以在培养基中悬浮生长的细胞。它们可以以单细胞或细胞团块的形式生长。悬浮细胞的传代通常比贴壁细胞更容易。

所需设备和试剂：

1.预热至37°C的完全培养基

2.70%乙醇（用于消毒）

3.台盼蓝

4.培养瓶和标签

5.倒置显微镜

6.吸管

7.血细胞计数器

8.离心机(如果需要分散细胞)

9.条件培养基(可选):

条件培养基是指培养细胞一段时间后收集的培养上清液，其中可能含有细胞分泌的生长因子和其他活性物质。对于某些细胞系，可以将少量条件培养基(例如10-20%)添加到新鲜培养基中，以促进细胞生长。但是，使用条件培养基需要谨慎，并根据具体细胞类型进行优化。

以下是悬浮细胞传代的步骤：

1.检查细胞状态:在显微镜下观察细胞的形态、密度和活力，并检查是否存在污染。健康的悬浮细胞通常呈圆形、明亮且具有折光性。

2.分散细胞(如果需要):对于容易结团的细胞，可以将细胞悬液转移到离心管中，以150xg离心5分钟。弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中，并用吸管轻轻吹打，使细胞分散成单细胞悬液。对于不结团的细胞，此步骤可以省略，直接进行下一步。

3.计数细胞:取少量细胞悬液(100-200µL)，用台盼蓝染色，然后使用血细胞计数器进行细胞计数和活力检测。

4.稀释和接种:根据细胞类型和生长速度，计算所需的细胞密度和培养基体积。使用新鲜的预热完全培养基将细胞悬液稀释至合适的浓度，然后将细胞悬液接种到新的、已标记的培养容器中。

5.培养细胞:将新的培养容器放入37°C、5%CO2的孵育器中进行培养。

6.定期观察和传代:定期观察细胞生长状态，根据细胞密度和活力，确定合适的传代时间和比例。

处理生长过度的细胞:

如果细胞密度过高，培养基颜色发生明显变化（例如，含酚红的培养基变黄），或细胞活力下降，则表明细胞可能生长过度。在这种情况下，建议降低接种密度，并更频繁地更换培养基，而不是简单地添加条件培养基。对于某些细胞系，可以考虑使用条件培养基来促进细胞的恢复，但需要根据具体情况进行调整。

掌握细胞传代技术是细胞培养成功的关键。本文详细介绍了贴壁细胞和悬浮细胞传代的具体步骤、所需材料以及一些实用技巧。虽然我们提供了通用的指导原则，但不同细胞类型在最佳传代时间、胰酶浓度、接种密度等方面存在差异。因此，在进行细胞传代操作前，务必查阅相关文献和细胞系的具体说明书，并根据实际情况进行优化调整。只有在实践中不断积累经验，才能更好地掌握细胞传代技术，确保细胞的健康生长和实验的顺利进行。希望本指南能够帮助您在细胞培养的道路上更加得心应手。