细菌培养防止污染！无菌技术的基础知识和注意事项

  细胞培养中最重要的是防止细胞被细胞以外的微生物污染，如细菌、真菌、支原体等。实验室的空气中、实验台上、实验人员的手和手指上、口腔中都存在着多种微生物。这些微生物的繁殖速度比细胞快，可以通过从培养基中窃取营养物质或释放有毒物质来杀死目标细胞。无菌操作是指为防止这些污染物并仅培养所需的生物材料（细胞等）而进行的操作。本文上海通蔚将为您概述了无菌技术和注意事项！

  培养材料和培养设备的准备

  首先，我们准备材料和设备，以避免将污染源引入进行无菌操作的环境中。

  所有用于培养的培养基、试剂、设备和容器均应灭菌。灭菌方法包括使用电烘箱的干热灭菌、使用高压蒸汽的高压灭菌(高压蒸汽灭菌)以及使用膜过滤器的过滤灭菌。

  玻璃移液器（测量移液器、驹込移液器、巴斯德移液器）装在移液器罐中并通过干热灭菌。此时，在移液器上放置棉塞可以降低微生物污染率。对于棉塞，请使用防水的蒲团棉代替脱脂棉。微量移液器吸头装在特殊的盒子中，用铝箔包裹，并在高压灭菌器中灭菌。由于高压灭菌后芯片上可能会附着水滴，因此使用前请彻底干燥。

  培养基和试剂灭菌后，进行无菌检查，确保其完全灭菌。对于培养基，加入少量培养基和血清；对于试剂，将少量培养基、试剂和血清放入透明管或35 mm培养皿中，并在37°C培养箱中放置约3天。如果存在污染，培养基会变得混浊，因此应将其丢弃并准备新的。

  如果无法使用上述灭菌方法，可用70%乙醇溶液消毒。将仪器和试剂带入超净工作台或安全柜时，应先用浸有70%乙醇或奥斯本的纱布擦拭外部后再放入。使用乙醇后，立即使用燃气燃烧器时请小心，因为它可能会着火。

  实验者准备

  实验者本身可能会引入微生物，因此在进行任何操作之前一定要穿着合适。指甲应剪短，长发应扎起来或塞进帽子里。用肥皂彻底清洗双手和肘部，并用70%乙醇。戴一次性乳胶手套也是一个好主意，因为如果指甲或手指有皱纹而无法充分消毒，或者手或手指有割伤，微生物可能会残留。手套还可以有效降低将病原体从标本传播给实验人员的风险。

  洁净工作台和安全柜

  无菌操作在洁净工作台或安全柜（II级或III级）等无菌环境中进行。两种类型都将空气通过称为HEPA过滤器的高性能过滤器输送到设备中，从而可以在保持设备内部无菌的同时完成工作，但由于它们的机制和功能不同，因此根据目的和材料使用它们用过的。

  洁净工作台在室内产生正压，并保护样品免受设备外部的微生物污染。供气上有过滤器，但排气上没有过滤器，因此内部样品可能会泄漏，使其不适合处理转基因生物和病原体。洁净工作台足以进行一般无菌操作。

  安全柜（II级或III级）在供气和排气上均配有负压和HEPA过滤器。因此，它不仅可以保持冰箱内部无菌，还可以防止设备内部的微生物泄漏到空气中，还可以用来处理重组生物和病原体。

  无菌操作流程

  使用洁净工作台或安全柜时，使用前0.5～1小时打开杀菌灯，使用前关闭。杀菌灯发出的紫外线具有很强的杀菌作用，但对人体和细胞也有危害，所以工作前一定要关灯，避免直视杀菌灯。稍微打开门，运转风扇5至10分钟，用70%乙醇或奥斯本等消毒剂擦拭工作台内部，然后开始无菌操作。操作时，门打开高度不超过25厘米。

  如果您携带介质、试剂或设备，请先用消毒剂擦拭表面，然后再将其放在工作台上。打开培养基瓶或移液罐的盖子时，首先用火焰对盖子周围区域进行消毒，因为微生物可能从瓶或罐的开口处进入。

  为防止进入工作台的微生物和灰尘落入并污染试剂和培养基，请打开煤气灯或酒精灯以产生向上的气流。同样重要的是不要让试剂瓶、培养瓶或培养皿打开，并避免将手或仪器放在打开的盖子上。

  灭菌后，用消毒液将用过的试剂、仪器擦拭干净，然后带出室外，用消毒液擦拭室内。关上门，关掉风扇，打开杀菌灯。杀菌灯发出的紫外线会降解塑料，因此最好在大约一个小时后将其关闭，而不是继续打开。

  污染防治措施

  污染大致可分为三种类型：细菌和真菌污染、支原体和病毒污染以及与其他细胞的交叉污染。

  细菌和真菌引起的污染可以通过肉眼或显微镜检查来确定，因为培养基会因pH值的变化而变得浑浊或变色。然而，支原体和病毒引起的污染和交叉污染很难通过肉眼或显微镜检查来区分，因此很难注意到污染，因此定期进行污染检测是个好主意。

  另外，为防止样本之间的交叉污染（与其他细胞的污染）和感染，避免同时将两种或两种以上的细胞带入实验台，并为每种细胞准备一套培养基和试剂。我们开始做吧。

  如果发现污染，我们将及时处理，防止感染传播给他人。

  以上，我们已经说明了无菌技术的概要和注意事项。通过确保灭菌和无菌技术可以在一定程度上防止污染。请务必理解每一步的含义并仔细执行操作。