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品质保证 · 通蔚试剂
021-54845833/15800441009品质保证 · 通蔚试剂
发布时间：2024-03-08 发布作者：上海通蔚生物
细胞为什么传代？如果继续在同一容器中培养细胞，培养密度会逐渐增加，导致细胞老化和细胞死亡。为了防止这种情况，将少量细胞移植到另一个容器中的过程称为“传代”。
传代程序根据细胞的性质略有不同，因此请务必检查哪种方法适合您正在处理的细胞。在本文中，我们将解释三种模式的传代程序：贴壁细胞、抗贴壁细胞和浮动细胞。
首先，我们来谈谈如何传代贴壁细胞。贴壁细胞在体外生长，直到培养容器的表面被细胞覆盖或直到培养基耗尽营养。最好在细胞增殖到这种程度之前进行传代。
为了传代细胞，首先将它们重组成悬浮液。尽管细胞附着程度因每个细胞系而异，但通常使用胰蛋白酶等蛋白酶将细胞从培养容器中分离出来。然而，这种方法可能并不适合所有细胞系，因为蛋白酶可能会干扰某些细胞系，或者酶可能会消化感兴趣的膜标记物或受体蛋白。在这种情况下，另一种方法是用细胞刮刀等物理刮除细胞并将其添加到少量培养基中以产生悬浮液。
步骤一：检查细胞状态
步骤二：从容器中取出介质
步骤三：用PBS(-)清洗（必要时重复）
步骤四：添加胰蛋白酶/EDTA
步骤五：孵育2-10分钟
步骤六：检查细胞状态
步骤七：添加新鲜培养基并悬浮
步骤八：在装有温热培养基的培养容器中播种
步骤久放入培养箱中
1、将培养基加热至37°C（或细胞随附的ECACC细胞系数据表上推荐的温度）
2、70%乙醇
3、PBS(-)（不含Ca 2+/Mg 2+的PBS）
4、0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液
5、胰蛋白酶抑制剂
6、台盼蓝
7、孵化器
8、培养容器和标签
9、倒置显微镜、相差显微镜
10、离心机
11、血球计数板（血球计数板）
12、记号笔
13、移液器
14、用于放置小瓶的架子
下面我们就来看看具体的步骤吧。
步骤一、检查细胞状态
使用显微镜观察细胞的状态（没有细菌或真菌等污染物）和汇合度（大约汇合度的百分比）。
步骤二、从容器中取出介质
打开抽吸器，用移液器吸取培养容器中的培养基并丢弃。吸取培养基时，稍微倾斜容器，从最深处吸取液体。最好从尽可能靠近培养皿或烧瓶侧面的地方吸起。
步骤三、用PBS清洗细胞
用培养用大约一半体积的PBS(-)（不含Ca 2+/Mg 2+的PBS）清洗细胞表面。如果细胞牢固附着，请重复几次。
步骤四、添加胰蛋白酶/EDTA
将1 mL胰蛋白酶/EDTA添加到25 cm的细胞表面进行清洗。缓慢旋转培养容器，使胰蛋白酶均匀分布在细胞表面，然后丢弃多余的胰蛋白酶。
步骤五、孵化
将培养容器放回培养箱中培养2至10分钟。
步骤六、检查细胞状态
在显微镜下观察细胞并确认细胞开始漂浮。如有必要，用手指轻轻敲击培养容器的侧面以松开任何卡住的细胞。
步骤七、添加新鲜培养基并悬浮
将细胞重悬于含有少量血清的培养基中以灭活胰蛋白酶。但是，请注意，如果您使用无血清培养基，则需要使用胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶。从悬浮液中取出约100-200µL，用台盼蓝等染色，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。
步骤八、在装有温热培养基的培养容器中播种
用温热的培养基填充新标记的培养容器并转移所需量的细胞。（请以ECACC细胞系数据表上记载的适量为标准。）
步骤九、放入培养箱中
在数据表中指定的适当条件下孵育细胞。
根据细胞的生长状况重复上述步骤。
执行此操作时需要记住几点。首先，根据某些细胞系的生长水平，它们可能会轻微粘附在表面并容易脱落。经常检查培养容器内的条件，注意不要在细胞尚未成熟时使细胞脱落。
在步骤3中，用PBS(-)冲洗细胞表面，去除培养基中含有的血清。此步骤非常重要，因为胰蛋白酶在血清存在下不具有活性。
当对细胞使用胰蛋白酶/EDTA时，请使用分离细胞所需的最短处理时间。长时间接触可能会损害细胞表面受体。非酶细胞分离剂（例如胰蛋白酶）也可用于分离细胞。建议在必要时使用它，例如当您想在温和的条件下去角质时。
将新细胞接种到培养容器中时，除非用血清中和胰蛋白酶，否则细胞不会粘附。除了使用血清外，胰蛋白酶抑制剂（例如源自大豆的抑制剂）也可用于中和胰蛋白酶。在这种情况下，首先将等体积的胰蛋白酶抑制剂（浓度1 mg/mL）添加到待中和的悬浮液中。然后，离心混合物，弃去上清液，并重悬于新鲜培养基中。当在无血清培养基中培养时，该过程特别有效。
如果没有CO 2培养箱，则用含有0.2µm过滤灭菌的5%CO 2空气进行气体交换1-2分钟。
如果收获的细胞密度不够，以150 x g离心5分钟，然后重悬于少量培养基中。
根据细胞系的类型，所有细胞可能不会粘附在培养容器上，并且可能部分培养为悬浮液。这些细胞必须传代以维持其细胞状态。
所需的一般流程、设备和试剂与贴壁细胞相同，但详细步骤有所不同。
一、检查细胞状态
使用显微镜观察细胞的状态（没有细菌或真菌等污染物）和汇合度（大约汇合度的百分比）。此时，如果通过敲击或摇动培养容器的侧面将细胞从培养容器中提起，则不再需要胰蛋白酶处理。
二、从容器中取出介质
用移液器去除含有非贴壁细胞的培养基。不要丢弃该介质，而是将其保存在无菌离心管中。
三、用PBS清洗细胞
对于培养容器表面上剩余的每25 cm2细胞，用1-2 mL PBS(-)清洗细胞表面。将洗涤后的PBS(-)保存在单独的管中。
四、添加胰蛋白酶/EDTA
用1 mL胰蛋白酶-EDTA清洗25 cm的细胞单层表面。缓慢旋转培养容器，使胰蛋白酶遍布细胞表面，然后丢弃多余的胰蛋白酶。
五、孵化
将培养容器放回培养箱中培养2至10分钟。
六、检查细胞状态
在显微镜下观察细胞并确认细胞开始漂浮。如有必要，用手指轻轻敲击培养容器的侧面以松开任何卡住的细胞。
七、添加新鲜培养基并悬浮
将提起的细胞转移至离心管中，加入保留的培养基，并将整个悬浮液以150×g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于少量新鲜培养基（10-20 mL）中，并对细胞进行计数。
八、将细胞接种到新容器中
将所需量的细胞放入新的培养容器中，并用新鲜培养基稀释至所购买细胞数据表上建议的细胞密度。
每2-3天重复一次上述步骤。
基本的预防措施与贴壁细胞的预防措施没有太大区别。
大多数细胞被胰蛋白酶分离，但通过添加EDTA可以进一步增强效果。
胰蛋白酶在血清存在下不具有活性。因此，在步骤3中，与贴壁细胞一样，通过用PBS(-)冲洗细胞表面来除去培养基中含有的血清。反复加热至37度也可能导致胰蛋白酶活性下降。
此外，当对细胞使用胰蛋白酶-EDTA时，处理时间应保持最短，就像贴壁细胞一样。对于半贴壁细胞，接触胰蛋白酶的时间比正常贴壁细胞短得多。
将新细胞接种到培养容器中时，除非用血清中和胰蛋白酶，否则细胞不会粘附。除了使用血清外，胰蛋白酶抑制剂（例如源自大豆的抑制剂）也可用于中和胰蛋白酶。
如果没有CO 2培养箱，则用含有0.2µm过滤灭菌的5%CO 2空气进行气体交换1-2分钟。
大多数浮游细胞是血细胞来源的细胞（淋巴细胞等），并在悬浮液中培养。这些细胞可以作为单个细胞或成簇生长（例如，EBV转化的B淋巴母细胞）。这种类型可以通过稀释培养相对容易地传代。然而，在某些情况下，例如形成团块的细胞系，必须将细胞离心至单个细胞，然后在计数前重新悬浮。
首先，让我们检查一下总体流程。请注意，仅当步骤3适用时才会执行标有星号(*)的步骤。
1、检查细胞状态
2、（150×g离心5分钟）*
3、（在新鲜培养基中添加约10-20%的条件培养基）*
4、采集细胞样本
5、测量细胞密度，稀释至适当密度，并悬浮在新培养基中。
6、每2-3天重复一次上述操作
1、将培养基加热至37°C（或细胞随附的ECACC细胞系数据表上推荐的温度）
2、70%乙醇
3、台盼蓝
4、孵化器
5、培养容器和标签
6、倒置显微镜、相差显微镜
7、离心机
8、血球计数板（血球计数板）
9、记号笔
10、移液器
11、用于放置小瓶的架子
现在，我们就来看看具体的步骤。为了避免对细胞造成压力，该方案建议通过将细胞添加到新的培养基中并传代来稀释细胞。另一种方法是离心，除去上清液，然后将细胞重悬于新鲜培养基中。
一、检查细胞状态
在显微镜下检查细胞的状态。如果细胞呈圆形、明亮且反光，则处于对数生长期。这时我们还要检查是否有细菌、霉菌等污染物。
二、分散细胞
对于容易粘附在培养容器上的细胞，例如杂交瘤，可通过轻轻敲击容器将其去除，或使用橡皮警察将其从容器中去除。或者，通过移液分散细胞。这是因为EBV转化的细胞可能形成单个大团块，从而难以对中心的细胞进行计数。
如果更换前的培养基颜色呈酸性（含有酚红的培养基变黄），则细胞可能已经过度生长，恢复可能很困难。在这种情况下，可以通过以下方式进行恢复：以150 x g离心约5分钟，以比所附数据表中推荐浓度稍高的细胞密度接种到新培养基中，并添加约10至20%的条件培养基。。
1、采集细胞样本并进行计数
从细胞悬浮液中取出少量（100-200µL），用台盼蓝染色，并对细胞进行计数。计算每毫升的细胞数，将所需量放入新的培养容器中，并用新培养基稀释至细胞随附的数据表上推荐的细胞浓度。
每2-3天重复一次上述步骤。
如果培养的细胞系是杂交瘤或产生重组蛋白或生长因子的细胞，则传代后的旧培养基也应保留以供以后分析。
步骤3中使用的条件培养基也称为条件培养基。指细胞培养一定时间（数小时至数天）后收集的培养上清液。含有细胞生长因子、细胞粘附因子、细胞毒性中和因子等，可能有助于细胞增殖和功能表达。
上面，我们已经解释了细胞传代的步骤。除了细胞类型之外，不同的细胞系可能需要不同的程序和条件。实际使用细胞进行实验时，请务必仔细阅读细胞附带的数据表，并在处理细胞时参考文献。