ELISA检测试剂盒：一文读懂其原理与应用

  ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种基于抗原抗体特异性结合的免疫学检测方法，用于定量或定性检测生物样品中各种靶标物质，包括蛋白质、抗体、激素、肽类等。

  ELISA (酶联免疫吸附测定) 是一种用于检测液体样品中靶向蛋白质的固相酶免疫测定 (EIA) 技术。在 ELISA 中，首先将靶向蛋白质（抗原）固定在固相载体表面，例如微孔板。然后，加入含有待测抗体的样品，并与固定的抗原进行结合。未结合的抗体会被洗涤去除。随后，加入酶标二抗，该二抗能够特异性识别结合在抗原上的抗体。最后，加入底物溶液，底物会在酶的催化下发生显色反应，颜色深浅与样品中靶向蛋白质的浓度成正比，通过检测颜色的变化即可定量或定性分析样品中靶向蛋白质的含量。

  ELISA试剂盒自从60-70年代问世以来，得到全世界科研工作者的认可及推崇，在欧美及中国获得很大的推广，尤其是国内生化领域的长足发展。

  ELISA生物实验敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA一直被用作植物病理学、医学和生物技术的重要工具之一。它是许多行业对其生物产品进行质量检查的首选检测方法。在96孔板中进行，可以在一次实验中测量和研究多个样品。它与其他抗体测定不同，因为它的数据再现性和定量结果。

  本文讨论了酶联免疫吸附测定(ELISA)的工作原理、其类型、优点和局限性及其在生命科学实验室和工业中的应用。

  酶联免疫吸附测定原理

  ELISA(酶联免疫吸附测定)的工作原理基于抗原抗体之间的特异性结合。抗体是生物体免疫系统产生的蛋白质，用于识别和结合特定的抗原，而抗原则可以是来自任何外来来源的分子，例如蛋白质、多肽、病毒等。

  在ELISA实验中，通常使用特殊的固相载体，例如聚苯乙烯微孔板，其表面可以吸附抗原或抗体。大多数情况下，抗原会被固定在微孔板表面，然后加入含有待测抗体的样品。如果样品中存在与抗原特异性结合的抗体，则会与固定的抗原结合。未结合的抗体会被洗涤去除。随后，加入酶标二抗，该二抗能够特异性识别结合在抗原上的抗体。最后，加入底物溶液，底物会在酶的催化下发生显色反应。颜色深浅与样品中靶向抗原的浓度成正比，通过检测颜色的变化即可定量或定性分析样品中靶向抗原的含量。

图1 elisa检测原理

  ELISA试剂盒类型

  ELISA分为常见4种类型，分别是直接ELISA法、间接ELISA法、夹心ELISA法和竞争ELISA法。

  直接ELISA法

  直接ELISA法是一种简单快速的ELISA方法，其原理是将抗原或蛋白质直接固定在固相载体表面，例如微孔板。然后，加入酶标抗体溶液，该抗体能够特异性识别和结合固定的抗原。未结合的抗体会被洗涤去除。随后，加入底物溶液，底物会在酶的催化下发生显色反应。颜色深浅与样品中靶向抗原的浓度成正比，通过检测颜色的变化即可定量或定性分析样品中靶向抗原的含量。

  虽然直接ELISA法操作简单，但由于其只使用一种抗体，因此特异性可能较低，容易产生较高的背景信号，即更高的显色或光密度读数，这可能会影响实验结果的准确性。

图2 直接ELISA法

  间接ELISA法

  间接ELISA法的步骤与直接ELISA法相似，但增加了一个使用酶标二抗进行检测的步骤，从而提高了检测的灵敏度。在间接ELISA法中，首先将抗原或蛋白质固定在微孔板的孔中。然后，加入含有待测抗体（一抗）的样品，并与固定的抗原进行结合。未结合的一抗会被洗涤去除。

  随后，加入酶标二抗，该二抗能够特异性识别并结合一抗。加入底物溶液后，底物会在酶的催化下发生显色反应。颜色深浅与样品中靶向抗原的浓度成正比，通过检测颜色的变化即可定量或定性分析样品中靶向抗原的含量。

  相比于直接ELISA法，间接ELISA法具有更高的灵敏度和更广泛的应用范围，因为可以使用多种不同的二抗进行检测。

图2 间接LEISA法

  夹心ELISA法

  夹心ELISA法是实验室中最常用的ELISA类型之一，其灵敏度和特异性都较高。在夹心ELISA法中，首先将捕获抗体固定在微孔板的孔中。然后，加入含有待测抗原的样品，并与捕获抗体进行结合。未结合的抗原会被洗涤去除。

  随后，加入检测抗体，该抗体能够识别抗原上的不同表位，并与之结合。检测抗体通常带有酶标或荧光标记。最后，加入底物溶液，底物会在酶的催化下发生显色反应或荧光反应。信号强度与样品中靶向抗原的浓度成正比，通过检测信号的变化即可定量或定性分析样品中靶向抗原的含量。

  夹心ELISA法的优势在于其使用了两种抗体来识别抗原，从而提高了检测的特异性和灵敏度，降低了背景信号的干扰。

图3 夹心ELISA法

  竞争法ELISA

  竞争ELISA法主要用于检测小分子抗原，其原理与其他ELISA方法有所不同。在竞争ELISA法中，首先将抗原或抗原类似物固定在微孔板的孔中。然后，将待测样品与酶标抗原或抗原类似物混合，并加入到微孔板中。样品中的抗原与酶标抗原竞争性地与固定的抗原或抗原类似物结合。

  未结合的抗原和抗体会被洗涤去除。随后，加入底物溶液，底物会在酶的催化下发生显色反应。如果样品中靶向抗原的浓度较高，则会与更多的酶标抗原竞争结合位点，导致酶标抗原的结合量减少，显色反应较弱，信号强度较低。相反，如果样品中靶向抗原的浓度较低，则酶标抗原的结合量会增加，显色反应较强，信号强度较高。

  通过检测信号强度与标准曲线的比较，可以定量分析样品中靶向抗原的含量。竞争ELISA法的优势在于可以检测小分子抗原，并且不需要制备针对小分子抗原的抗体。

  ELISA试剂盒检测步骤

  以下是进行ELISA实验的一般步骤。但需要根据具体实验进行调整：

  准备工作

  准备包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、抗体溶液、底物溶液和终止液。

  将试剂盒从冰箱中取出，恢复至室温。

  打开酶标仪预热，设置检测波长。

  包被

  向微孔板的孔中加入100µL肽溶液(4µg/mL，用包被缓冲液稀释)。

  将板在37℃下孵育2小时或在4℃下孵育过夜。

  封闭

  除去包被溶液，并用100µL洗涤缓冲液(PBS-0.05%Tween20)洗涤3次。

  用纸巾擦干板子。

  向每个孔中添加100µL封闭缓冲液(3%脱脂牛奶的PBS溶液)。

  将板在37℃下孵育1小时。

  加样

  用洗涤缓冲液洗涤板子3次。

  向每个孔中添加50µL稀释的一抗溶液(稀释比例根据具体实验确定)。

  将板在37℃下轻轻摇动孵育1小时。

  洗涤

  重复洗涤步骤3次，每次使用100µL洗涤缓冲液。

  显色

  向每个孔中添加50µL稀释的酶标二抗溶液(稀释比例根据具体实验确定)。

  将板在37℃下孵育1小时。

  用洗涤缓冲液洗涤板子6次。

  将TMB底物溶液、乙酸和0.03%H2O2按照1:4:5的比例混合，制备显色底物溶液。

  向每个孔中加入50µL显色底物溶液。

  将板在37℃避光孵育15-30分钟。

  终止反应

  显色足够后，向每个孔中添加100µL终止液。

  读数

  使用酶标仪在指定的波长下读取每个孔的吸光度值。

  ELISA检测的优点和局限性

  优点：

  操作简便：ELISA实验方案简单易行，只需进行基本的实验操作，即可完成检测。

  高通量：现如今ELISA可以使用96孔板或384孔板进行检测，能够同时处理大量样品，提高检测效率。

  灵敏度和特异性高：ELISA利用抗原抗体之间的特异性结合进行检测，可以检测到样品中微量的靶标物质，并具有较高的特异性，能够区分目标物质和其它相似物质。

  适用样品类型广泛：ELISA可以检测各种类型的样品，例如血清、血浆、细胞和组织提取物、尿液、唾液等。

  定量分析：ELISA可以通过标准曲线定量分析样品中靶标物质的浓度，提供更精确的检测结果。

  结果快速：ELISA实验通常可以在数小时内完成，能够快速获得检测结果。

  成本效益高：ELISA试剂盒价格相对便宜，操作简单，无需昂贵的设备，因此具有较高的成本效益。

  局限性：

  结果易受影响：ELISA结果容易受到多种因素的影响，例如操作误差、试剂质量、样品处理等，需要严格控制实验条件，确保结果的准确性。

  半定量检测：虽然ELISA可以进行定量分析，但其准确性不如一些其他定量方法，例如质谱法。

  信息有限：ELISA只能检测靶标物质的存在和含量，无法提供有关靶标物质结构、功能等信息。

  交叉反应：某些情况下，抗体可能与样品中的其他物质发生交叉反应，导致假阳性结果。

  背景信号：ELISA实验中可能会出现背景信号，影响检测结果的准确性，需要进行适当的校正。

  Elisa试剂盒应用

  ELISA（酶联免疫吸附测定）作为一种灵敏、特异且用途广泛的免疫学检测方法，在生命科学、生物技术和医学领域拥有广泛的应用。以下列举一些重要的应用领域：

  抗体和抗原检测：ELISA可以用于检测各种生物样品中的抗体和抗原，例如血清、血浆、细胞培养上清液等。这使得ELISA成为研究免疫反应、疾病诊断和疫苗开发的重要工具。

  传染病诊断：ELISA是许多传染病诊断的金标准方法，例如HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等。它可以检测患者血清中的病毒抗原或抗体，帮助医生进行早期诊断和治疗。

  疾病监测和流行病学研究：在疾病爆发期间，例如最近的COVID-19大流行，ELISA快速检测试剂盒被广泛用于评估疾病的传播范围和趋势，为公共卫生决策提供重要数据。

  食物过敏原检测：ELISA可用于检测食品中的过敏原，例如花生、牛奶、鸡蛋、坚果等，帮助食品生产商确保食品安全，并为过敏人群提供指导。

  自身免疫性疾病诊断：ELISA可用于检测自身免疫性疾病相关的自身抗体，例如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等，帮助医生进行疾病诊断和监测。

  药物研发：ELISA在药物研发过程中发挥着重要作用，例如用于药物筛选、药代动力学研究、毒理学研究等。

图4 通蔚生物试剂盒

  最后，相信大家通过上文对ELISA试剂盒原理有所了解。通蔚提供多种经济实惠且有效的ELISA试剂盒，主要采用夹心法和竞争法，覆盖3000个靶标，涉及小鼠、大鼠、牛、兔、猪等20多个种类。