PCR技术及其在生物和医学中的应用

  PCR已经对生物学产生了变革性的影响，因为它可以将极少量的DNA扩增到可以分析的数量。以前，增加DNA数量的唯一方法是利用细菌来产生更多副本。这个过程非常耗时，需要将DNA片段转移到质粒或其他载体中，将组合的DNA引入细菌细胞，培养大量细菌，然后再次从细菌中纯化DNA片段。使用PCR，可以快速大量生成特定的DNA序列，而无需将DNA转移到细菌中来产生副本。这使得纯化DNA片段变得更加容易。

  与生物体不同，PCR只能复制短DNA片段，通常长度不超过10千碱基对(kb)。有些技术可以复制长达40kb的片段，这仍然比真核细胞的染色体DNA短得多。例如，人类细胞有大约30亿个碱基对，远远超过PCR可以复制的最大DNA长度。

  PCR已成为研究实验室中用于多种用途的必备工具，例如基因克隆、测序和测量基因表达。此外，它在医学上还用于准确识别微生物，包括单个病原体或多种生物群，例如肠道微生物群中的微生物。

  在医学和生物研究实验室中，PCR是一种常用技术，用于各种目的，包括识别遗传疾病、建立基因指纹、诊断传染病、克隆基因、进行亲子鉴定和DNA计算。

  PCR过程如何进行？

  PCR需要几个基本组分的存在，包括：

  1.包含要扩增的DNA片段的DNA模板或cDNA。

  2.两个引物，用于识别要扩增片段的起点和终点

  3.Taq聚合酶，它复制要扩增的片段。

  4.核苷酸，是DNA聚合酶合成新DNA链的组成部分。

  5.缓冲溶液，为DNA聚合酶的功能提供适当的化学环境。

  PCR反应在热循环仪中进行，热循环仪是一种能够精确加热和冷却其中的反应管以达到每个反应阶段所需温度的设备。为了防止反应混合物蒸发，在反应管顶部放置加热盖，或在反应混合物表面添加一层油。

  在深入研究PCR过程之前，彻底了解其基本原理非常重要。PCR依靠四种核苷酸碱基，即腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤，即使来自有限的来源，也能扩增高质量的DNA片段。通常，单个PCR循环涉及30-35次重复，大约需要两个小时才能生成可用量的DNA片段。通过结合多重PCR、RT-PCR、嵌套PCR、反向PCR、菌落PCR、不对称PCR、解旋酶PCR、连接介导PCR等细微变化，可以定制PCR以产生更好的结果。PCR反应涉及20-40个循环，每个循环有三种不同的温度。

  PCR每个循环包含三个关键步骤，包括变性、引物退火和最终延伸。

  变性

  PCR中的变性过程包括将DNA样本加热到95°C左右，通过破坏两个互补碱基之间的氢键将双链DNA分离为单链DNA。在标准PCR反应中，此变性阶段通常需要15-30秒。

  引物退火

  第二步称为退火，温度降低到60°C左右。这允许引物附着到DNA样本中的互补序列上，并且温度保持约15-60秒，具体取决于引物的长度。较长的引物与精确目标序列的结合更特异性。退火温度足够低，以使引物碱基与目标DNA形成氢键，并且它根据目标DNA和引物的序列确定。

  最终延伸

  第三步是延伸或延长，此时温度升高到所用热稳定DNA聚合酶的理想温度，通常约为72°C。在此温度下，DNA聚合酶使用核苷酸延伸或延长引物，从而产生新的互补DNA链。延伸阶段的持续时间取决于目标DNA的长度，目标越长，DNA聚合酶需要的时间就越长，才能产生完整的副本。

  PCR在生物学和医学中的应用

  PCR在医学领域的主要应用之一是快速诊断。研究人员已经能够使用PCR快速识别HIV、单纯疱疹病毒(HSV-2)等病毒以及白色念珠菌等真菌种类，帮助医生比传统检测方法更快地确诊。事实上，由于其灵活性和准确性，PCR已成为识别临床环境中相关病原体的不可或缺的工具。

  PCR的高灵敏度也使其在诊断罕见疾病时从其他实验室技术中脱颖而出，因为与疾病相关的基因突变可能仅发生在少数细胞中。

  除了检测病原体，PCR还可用于通过量化mRNA水平来评估样本中的基因表达水平。这可提供有关细胞健康的有用信息，并可帮助医疗专业人员诊断癌症或严重疾病。

  在生物学研究领域，PCR仍然在世界各地的现代实验室中发挥着重要作用，因为它可以深入了解生物体如何进化以及生物体如何相互作用。它还可用于分析以前未表征的基因或通路以及从群体中筛选突变体。由于其广泛的实际应用，自三十年前推出以来，无数科学家一直在使用PCR——使其成为当今研究人员可以使用的最强大的分子工具之一。

  在研究和诊断中检测DNA序列

  PCR一直是用于在研究和临床诊断中检测DNA序列的有力工具。从历史上看，限制性酶使研究人员能够检测和分析各种基因异常，但PCR可以用更少的样本材料提供更精确的结果。PCR确实存在一些缺点，在考虑将其用于特定应用时必须权衡这些缺点。由于该方法依赖于获取要扩增的特定DNA序列，因此目标序列内的任何变化都可能导致结果无用或不准确。此外，由于其特异性，应始终使用其他检测或测序方法（如桑格测序）进一步确认研究结果。但也许最重要的是考虑与其他方法相比的成本——有时根据可用资源，其他流程可能更合适。

  PCR在检测DNA序列方面具有深远的意义，并且已被证明是推动研究和诊断发展的关键。这些进步为更深入地了解遗传组成和识别可能被忽视的疾病提供了巨大的机会。