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ELISA结果 - 定量、定性和灵敏度

发布时间:2024-02-02     发布作者:上海通蔚生物

在ELISA试剂盒测定产生三种不同类型的数据输出:

定量

可以通过与标准曲线(已知纯化抗原的连续稀释)进行比较来解释 ELISA 数据,以便精确计算各种样品中抗原的浓度(图 1)。

定性

ELISA 还可用于获得“是”或“否”的答案,表明与不含抗原或不相关对照抗原的空白孔相比,样品中是否存在特定抗原。

半定量

ELISA 可用于比较测定样品中抗原的相对水平,因为信号强度将直接随抗原浓度变化。

标准曲线

ELISA 数据通常用光密度与对数浓度作图,以生成 S 形曲线,如图 1 所示。已知浓度的抗原用于生成标准曲线,然后通过与已知浓度的抗原进行比较,使用该数据来测量未知样品的浓度。标准曲线的线性部分。这可以直接在图表上完成,也可以使用 ELISA 读板机上常见的曲线拟合软件来完成。

elisa数据

 1. 典型的 ELISA 标准曲线。

校准曲线模型

如果需要定量结果,最简单的方法是对三份标准读数进行平均,并扣除空白对照样品的读数。接下来,绘制标准曲线,找到最佳拟合线或至少绘制一条点对点曲线,以便可以确定样品的浓度。在此阶段需要调整任何稀释度。这通常是可以进行手动计算的实际程度。

一种变体是使用半对数、对数/对数、对数/对数及其导数(4 或 5 参数逻辑模型)绘制数据。使用基于软件/自动化的解决方案可以考虑更复杂的绘图方法。在软件包中使用线性回归增加了更多检查的可能性;可以检查 R2 值以确定总体拟合优度。对于浓度与读数之间呈线性关系的曲线部分,R2 值 >0.99 表示非常适合。然后可以通过使用该范围内的更多标准浓度来进一步提高准确性。

线性图的一方面是它压缩了标准曲线较低浓度上的数据点,从而使其成为最准确的范围(最有可能达到所需 R2 值的区域)。为了抵消这种压缩,可以使用半对数图表;这里,浓度值的对数(x 轴)相对于读数(y 轴)绘制。该方法给出了 S 形数据曲线,将更多的数据点分布到更用户友好的 S 形模式中。

对数/对数(浓度对数与读数对数)绘图类型设法使更多数据曲线线性化。在此模型中,低到中标准浓度范围通常是线性的,只有范围的高端倾向于倾斜。 log/logit 及其导数(4 或 5 参数逻辑模型)更加复杂,需要更复杂的计算和最大值、最小值、EC50 和斜率值的估计。 5 参数模型还需要不对称值。

虽然这些校准曲线模型可以提供改进的性能,但一个好的起点是使用双对数图并检查回收率(加标样品中的分析物回收率)。或者,至少“反向拟合”标准曲线读数值通常是“足够好的”方法。最简单的检查方法是反算校准标准并检查它们是否在标称读数值的 20% 范围内。需要注意的是,不要依赖“良好”的 R2 值并找到可为标准品提供最佳回收率值的校准曲线模型。

ELISA 灵敏度

ELISA 是可用的最灵敏的免疫测定之一。 ELISA 的典型检测范围为 0.1 至 1 fmole 或 0.01 ng 至 0.1 ng,灵敏度取决于抗体-抗原相互作用的特定特征。此外,一些底物(例如产生增强化学发光或荧光信号的底物)可用于改善结果。

如前所述,间接检测会产生更高水平的信号,因此应该更灵敏。然而,它也可能导致较高的背景信号,从而降低净特定信号水平。

elisa试剂盒

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