免疫检测实验：标记物类型介绍

  抗体标记，或将特定标记附着到抗体上以帮助检测或分离/纯化蛋白质，是一项重要的技术。标记抗体对于蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术、免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)等基于免疫的测定至关重要。标记抗体还用于从复杂的蛋白质混合物中分离和纯化单一蛋白质。与其他蛋白质一样，抗体可以用小分子、放射性同位素、酶蛋白和荧光染料标记。

  传统上，通常采用两种不同的化学方法来标记与小分子共价的抗体：

  1.该标记与伯胺发生反应，用于标记抗体分子中的赖氨酸残基

  2.抗体链内的二硫键被还原，然后与硫醇反应性标记发生反应

  目前，已经开发出更新的方法，包括将标记非共价添加到抗体的Fc部分，或将标记共价添加到抗体重链的N连接聚糖上。使用的标记物类型取决于下游应用。终点将关注抗体的非放射性标记及其用途。下文总结了不同免疫测定中使用的标记类型。

  生物素标记

  生物素是一种小分子，其结合亲和素（存在于蛋清中）和链霉亲和素（由链霉菌链霉菌产生）形成自然界中最强的非共价相互作用之一。由于其大小，生物素很少破坏抗体的活性，使其成为标记物的不错选择。

  生物素标记抗体用于蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术、免疫荧光和免疫组织化学，当抗原难以检测时，通常采用生物素标记抗体来提高测定的灵敏度。通常，印迹或样品与生物素标记的抗体一起孵育，然后与用酶或荧光染料标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白进行第二次孵育。抗体通常与多个生物素分子（3-6个分子）缀合，从而产生扩增步骤，从而增强对丰度较低的抗原的检测。虽然生物素标记物可以改善检测，但它可能难以用于蛋白质的分离/纯化，因为生物素和（链霉）亲和素之间的强相互作用可能难以破坏。

  许多公司销售生物素化试剂盒，其中含有反应性生物素分子，可轻松标记蛋白质。通常，通过使用生物素类似物的N-羟基琥珀酰亚胺酯将抗体标记在赖氨酸的ε-氨基上。生物素使用至少6个原子的间隔臂附着在蛋白质上，以防止下游操作过程中的空间障碍。间隔臂的长度和成分可以不同，以优化测定。

  酶标记

  传统上，Western、ELISA和IHC最常用的抗体标记是酶标记。酶标记比生物素大，但它们很少破坏抗体功能。最常用的酶标记是辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。

  要使用酶标记抗体，将样品与酶特异性底物一起孵育，酶催化底物产生有色产物（显色测定）或光（化学发光测定）。每种酶都有一组可用的底物和检测方法。例如，HRP可以与二氨基联苯胺反应产生棕色产物，或与鲁米诺反应产生光。相比之下，AP可以与对硝基苯磷酸酯（pNPP）反应生成黄色产物（通过分光光度计检测）或与5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）和硝基蓝四唑（NBT）反应生成黄色产物紫色沉淀。显色测定可用于蛋白质印迹、ELISA和IHC，而生光反应最常用于蛋白质印迹。许多具有不同灵敏度和输出的底物可用于检测，使酶报告基因成为最流行的抗体标记之一。

  尽管报道酶也与赖氨酸的ε-氨基缀合，但由于酶含有赖氨酸并且具有多聚化的潜力，因此可以采用额外的化学方法。酶标记二抗可通过多家公司广泛获得，而其他公司则销售用于在实验室中标记抗体的试剂盒。

  荧光标记

  实验室中荧光标记抗体的使用正在稳步增加。由于荧光染料直接与抗体缀合，因此检测不需要酶/底物或结合相互作用。因此，检测到的荧光信号量与样品中目标蛋白的量成正比。荧光标记用于荧光Western测定、流式细胞术和IF，可用于高度定量测定。

  为了检测荧光标记，需要一种仪器来发射激发荧光染料的指定波长的光。然后荧光染料发出不同波长的信号。同一仪器包含适当的过滤器，用于检测荧光染料的发射。流式细胞术需要使用流式细胞仪，而IF则使用荧光显微镜。数字成像系统通常用于蛋白质印迹。抗体可以用具有不同激发和发射光谱的多种荧光染料标记。除了高度定量之外，荧光标记还具有独特的优势，即通过使用具有不重叠发射光谱的染料，能够同时检测两种或多种不同的目标蛋白。

  对于标记，荧光标记物可以通过伯胺或硫醇基团共价连接到抗体上。荧光标记的抗体可以从许多公司购买，或者可以使用商业试剂盒在实验室中标记抗体。