酶联免疫吸附测定：生物医学研究中的得力助手

  什么是酶联免疫吸附测定？我们普通口语常说的elisa其实叫“酶联免疫吸附测定”，ELISA是使用抗体的免疫测定（免疫测定）之一。抗体是由于异物抗原进入体内引起免疫反应而产生的蛋白质。抗体属于免疫球蛋白(Ig)蛋白质家族。免疫球蛋白(Ig)有以下类别：

  G(IgG)、M(IgM)、A(IgA)、D(IgD)和E(IgE)。免疫测定中使用的抗体主要是IgG。IgG是一种分子量约为146,000的糖蛋白，由两条H链（分子量约为50,000）和两条L链（分子量约为25,000）组成。抗体具有仅与导致其产生的抗原结合的特性（特异性结合能力）。抗原是一种物质，具有：

  1)产生抗体的特性（免疫原性）和与抗体特异性结合的特性（特异性结合）。

  2)与抗体结合但不具有产生抗体特性的物质称为半抗原。一般来说，大分子量的物质，例如蛋白质，具有充当抗原的特性。

  3)分子量小于1000的物质，例如类固醇激素或寡肽，它们像蛋白质一样由氨基酸连接而成，但氨基酸数量较少，因此分子量较小，无法产生抗体，具有半抗原特性。问题是，为什么有抗体与半抗原结合，即使它们不产生抗体。事实上，当半抗原与大蛋白质分子（称为载体）结合并进行免疫时，就可以产生抗体。免疫学测定是使用抗体作为结合试剂的测定，抗体具有仅与目标物质结合的优异的特异性结合能力，以及允许它们结合微量物质的强亲和力。

  ELISA是一种使用抗体和酶的测量方法

  ELISA中如何使用抗体？ELISA通常使用96孔的微孔板。首先，抗体被吸附到孔的表面（也称为涂层或固定）。这种抗体称为捕获抗体，用于捕获作为待测物质的抗原。抗体可以被认为大致呈Y形。Y尖端有一个可变区，可识别并结合抗原。抗体吸附在孔底手柄易吸附的部分。孔的材料主要是聚苯乙烯，天然很容易吸附蛋白质，但考虑到各种结构后，它变成了特别容易吸附蛋白质的材料。当向其中添加抗体溶液时，会自动发生吸附。通过吸附尽可能多的抗体，甚至可以捕获极少量的抗原。

  那么，如何使用捕获抗体呢？我们用示意图来解释一下。为了屏幕方便，这里仅显示一种抗体。事实上，许多抗体被吸附。

图1、elisa试剂盒

  将含有抗原的溶液（标准溶液、标本或测量样品）加入到孔中固定化抗体中，并放置一段时间，通常为1至2小时，直至抗原与抗体结合。抗体.马苏.结合完成后，丢弃多余的溶液并清洗孔。这样，只有与固定化抗体结合的抗原保留在孔中。

  接下来，添加一种抗体（称为第二抗体），该抗体可识别与抗原捕获抗体所识别的表位不同的表位。我会把它留一会儿。该第二抗体预先与酶化学结合。添加的酶标记第二抗体识别并结合与捕获抗体结合的抗原。然后，洗去多余的酶标二抗。接下来，添加酶的显色底物溶液以允许酶反应发生。显色底物通过酶的作用转化为色素。因此，通过添加反应终止液来终止酶反应后，使用96孔微孔板比色计测量染料的显色。这样，可以将与捕获抗体结合的抗原的量作为染料进行测量。比色测定的结果以吸光度表示，因此以标准品的测定结果为横轴，以抗原浓度，纵轴为吸光度，绘制校准曲线，计算出样品中抗原的量由此。图中所示的ELISA实现方法是最简单的方法。由于酶的分子量相当大，使用该方法时，用酶标记抗体可能会对抗体的结合能力造成空间阻碍。

图2、elisa夹心法

  设计了一种通过将酶与另一种蛋白质结合来减少抗体的空间位阻的方法。如图所示，二抗带有生物素标记。生物素是一种分子量非常小的物质。生物素是一种原本存在于生物体中的生理活性物质，蛋清中含有一种叫做亲和素的蛋白质，它与生物素的结合力非常强。通过将酶与该亲和素结合，并使其与与抗原结合的生物素标记的第二抗体反应，可以克服空间位阻。这种改进方法也用于ELISA。ELISA也称为夹心法，因为它采用抗体-抗原-抗体格式。