一文详解酶联免疫吸附实验（ELISA）原理

    ELISA是“酶联免疫吸附试验”的缩写。ELISA广泛用于定量未知溶液中的蛋白质或抗原的研究方法，或在医学上用作诊断工具。ELISA灵敏度高、操作简单，可用于检测血液样本中是否存在传染病抗体、检测新分离的抗体与其靶蛋白的结合情况，或用于其他各种依赖于抗原-抗体结合（抗体-抗原相互作用）的检测。

    Elisa检测原理

    ELISA使用96孔板，孔板是聚苯乙烯材质使检测样本吸附在其表面。固定化使抗原与其检测抗体结合，然后洗脱未结合的抗体，最后进行抗原测定。与检测抗体连接的酶将与在最后一步中添加的底物相互作用，产生与抗原成比例的信号。

    四种ELISA类型

    1、直接ELISA：将含有目的抗原的未知样本直接粘附在孔中，然后用一抗进行检测。

    2、间接ELISA：开始方式与直接ELISA相同，但一抗不与酶连接，必须使用二抗进行检测。

    3、夹心ELISA：首先将抗体吸附到板上。然后加入含抗原的样品，抗原被固定的抗体捕获，并进行检测，类似于直接或间接方法。

    4、竞争性（或抑制性）ELISA：其设置与其他三种方法类似，但标记的是抗原而不是抗体。在未知样本之后添加标记抗原，以观察样本中有多少未标记抗原与标记抗原竞争。与其他三种方法不同，竞争性ELISA信号更强，意味着竞争较少，因此未知样本中的抗原也较少。

图 1.夹心 ELISA 检测示意图

    间接ELISA与直接ELISA的区别

    间接和直接ELISA（图2）的唯一区别在于所使用的检测抗体。

    直接ELISA仅使用一种抗体。这种一抗直接与检测酶偶联。间接ELISA的起始方法与直接ELISA相同，但需要两种抗体，即一抗和二抗进行检测。

图 2.直接检测（左）免疫测定法速度最快，但严格度较低，因此非常适合需要快速读数但对准确性要求不高的检测。间接检测（右）免疫测定法通过引入偶联二抗，提高了直接检测免疫测定法的特异性。

    间接ELISA有何用途？

    间接ELISA用于检测样本中的抗体以量化免疫反应。

    直接ELISA有何用途？

    直接ELISA适用于表位定位、定量和定性抗原检测以及抗体筛选。

    夹心ELISA测试的目的是什么？

    最常用的ELISA检测之一是夹心法（图1），常用于过敏测试或检测食品中的过敏原蛋白以进行质量控制。夹心法ELISA的灵敏度比直接或间接ELISA法高2-5倍。该检测在96孔板中进行，可同时检测多种条件和重复样本。

    夹心ELISA的步骤/方法

    夹心ELISA检测使用微孔板读数仪进行。孔底结合有针对目标抗原的特异性抗体。将样品放入孔中，如果样品中存在目标抗原，该抗体将与固定的抗体结合。然后使用标记的第二抗体检测结合的抗原。检测抗体与一种酶偶联，当加入底物时，该酶会引起颜色变化，因此可以使用微孔板读数仪进行检测。也可以使用HRP二抗（例如用于化学发光蛋白质印迹法的二抗）进行检测。基于吸光度的酶标仪，可测量与酶反应产物相关的特定波长的光吸光度。吸光度酶标仪可定量分析阳性样本和阴性样本之间的差异。

综上所述，ELISA技术的广泛应用证明了其在现代科学检测中的重要地位。对于每一位科研工作者来说，掌握其原理并非纸上谈兵。只有深刻理解从抗体包被、封闭到酶促反应的每一步细节，我们才能在面对复杂的生物样本和微弱的信号时游刃有余，精准地解决实验难题，从而真正发挥这项经典技术的最大潜力，为科学发现提供坚实可靠的数据支持。