细胞解冻：步骤、技巧及注意事项

细胞通常以冷冻状态交付。因此，正确解冻对于获得高细胞存活率和理想的细胞状态至关重要。本文将介绍细胞解冻方法和要点。

细胞解冻概述

阅读细胞的数据表:仔细阅读供应商提供的数据表，了解特定细胞系的解冻步骤和建议。

1.准备材料:预热合适的培养基至37°C(或根据数据表)，并准备好已灭菌的培养瓶/皿(如有需要，进行预先包被)。

2.取出细胞:从液氮或-80°C冰箱中取出冻存管。注意安全操作，避免冻伤。

3.快速解冻:将冻存管迅速放入37°C水浴中，并轻轻摇晃，使细胞尽快解冻(通常1-2分钟)。避免完全解冻，冻存管中仍留有少量冰晶时即可取出。

4.稀释细胞:将解冻的细胞缓慢加入预热的培养基中，轻轻混匀。根据数据表建议的比例进行稀释。

5.孵育细胞:将细胞悬液转移至准备好的培养瓶/皿中，并在推荐的温度(通常37°C)和CO2浓度下孵育。

6.观察细胞:在解冻后不同时间点(例如，24小时、48小时)观察细胞的生长状态和形态，确保细胞正常复苏。

细胞解冻所需材料

1.细胞冻存管

2.培养基(参考细胞数据表确定最佳预热温度)

3.70%乙醇

4.台盼蓝(可选，用于评估细胞活力)

5.个人防护设备(实验室手套、实验服、防护眼镜、液氮罐皮手套等)

6.用于运输冻存管的容器(例如泡沫塑料盒，如果需要从液氮罐中取出细胞)

7.37°C水浴

8.移液器和合适的吸头

9.小瓶支架(可选)

(如果需要进行后续细胞培养和观察):

10.孵化器

11.培养瓶/皿和标签

12.倒置显微镜/相差显微镜

13.血细胞计数器(可选)

14.离心机(可选，如果需要去除DMSO)

细胞解冻步骤

1.查看数据表:仔细阅读细胞随附的数据表，了解具体的培养条件和解冻步骤。

2.准备工作:在生物安全柜中进行所有操作。预热培养基至37°C，准备好培养瓶/皿并贴好标签(传代号、细胞名称、批号和日期)。

3.取出冻存管:从液氮罐或-80°C冰箱中取出冻存管。注意安全操作，佩戴合适的防护措施(例如低温手套和护目镜)。

4.处理液氮(如果需要):如果发现冻存管内有液氮，应在安全柜中静置片刻，待液氮气化后再打开。

5.解冻细胞:将冻存管迅速放入37°C水浴中，轻轻摇晃，使细胞尽快解冻(通常1-2分钟，当冻存管中仍留有少量冰晶时即可取出)。注意不要将盖子浸入水中。

6.擦拭表面:用70%乙醇棉签擦拭冻存管外表面。

7.稀释细胞:在生物安全柜中打开冻存管，用移液器将细胞悬液转移到装有预热培养基(例如5-10mL)的离心管中，轻轻混匀。

8. (可选)细胞计数和活力检测:取少量细胞悬液，用台盼蓝染色，并用血细胞计数器进行计数和活力评估。

贴壁细胞系:将细胞悬液转移到培养瓶/皿中，加入适量预热培养基至推荐体积。

悬浮细胞系:以150xg离心5分钟，弃上清，用新鲜预热培养基重悬细胞，然后转移到培养瓶/皿中。

9.培养细胞:将细胞放入孵化器中，在指定的温度和CO2浓度下培养。

10.观察细胞:24小时后(或根据细胞类型调整时间)在显微镜下观察细胞状态，并根据需要进行传代培养。

解冻细胞时的注意事项

1.快速解冻:将冻存管在37°C水浴中快速解冻(通常1-2分钟)，并轻轻摇晃，使内容物均匀受热。避免完全解冻，冻存管中仍留有少量冰晶时即可取出。

2.立即稀释:将解冻的细胞悬液立即加入预热至37°C的培养基中，轻轻混匀。

3.去除DMSO(强烈建议):除非细胞系明确对DMSO不敏感且数据表中明确说明无需去除，否则建议通过离心(例如200-300xg，5分钟)去除DMSO。弃去上清液，用新鲜预热培养基重悬细胞。

4.避免缓慢解冻:不要在室温或培养箱中解冻细胞，因为缓慢解冻会降低细胞活力。

5.CO2培养箱:使用CO2培养箱进行细胞培养。如果没有CO2培养箱，建议使用替代方案，例如含HEPES缓冲液的培养基。

6.传代培养:在细胞达到完全汇合之前进行传代培养，以保持细胞的最佳生长状态。一些细胞类型(例如NIH3T3)对接触抑制特别敏感。

7.恢复缓慢的细胞:对于生长缓慢的细胞(例如一些杂交瘤)，可以考虑在补充有20%FBS和10%条件培养基的培养基中培养，以促进其恢复。

以上，我们讲解了细胞解冻的正确步骤和注意事项。正确执行基本操作对实验的效率和成功至关重要。尤其是在熟悉实验步骤的过程中，您很可能会犯错并失败，因此请务必不时阅读这些注意事项。