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【通蔚生物】: 蛋白浓度测定和操作说明

发布时间:2021-11-10     发布作者:上海通蔚生物

蛋白浓度检测是一个实验,是根据吸光值可以推算出蛋白浓度.碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+, Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。

操作说明
一. 微孔酶标仪法
1. 配制工作液:根据标准品和样品数量,按50体积 BCA试剂A 加1体积 BCA试剂B(50:1)配制成 BCA工作液,充分混匀 (混合时可能会有浑浊,但混匀后就会消失)。BCA 工作液室温 24 小时内稳定。
2. 稀释标准品:取 10μL BSA 标准品用 PBS 稀释至 100μL(样品一般可用 PBS 稀释),使终浓度为 0.5mg/ml。将标准品按 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 μL加到 96 孔板的蛋白标准品孔中,加 PBS 补足至 20μL。
3. 将样品作适当稀释(最好多做几个梯度,如作 2 倍、4 倍、8 倍稀释),加 20μL到 96 孔板的样品孔中。由于移液器在取小量样品时误差偏大,标准线前面的点可能不很准确,所以尽可能的让样品点落在标准线 1/2 后。
4. 各孔加入 200μL BCA 工作液,37℃放置 15-30 分钟。用酶标仪测定 A562nm,根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时,应注意防止因水分蒸发影响检测结果。

二. 蛋白浓度分光光度计法
如没有酶标仪,可用分光光度计在离心管中混匀后加入比色皿中比色。

蛋白浓度注意事项:
1. 长期不用时,BCA试剂B与PBS 稀释液可置于 2-8℃保存,如发现细菌污染则应丢弃。BCA试剂A在低温条件下出现结晶沉淀时,可 37℃温育使其完全溶解, 不影响使用。
2. 样品中若含有较多干扰物质时,请采用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒。
3. 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中,蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中,否者待测蛋白不蛋白标准中所含非蛋白成分不一致,有可能导致测定不准确。
4. 待测蛋白和蛋白标准加入 BCA 工作液后,如果发现检测效果不佳,可以室温放置 2h或 60℃放置 30min,颜色会随着时间的延长不断加深。显色反应也会随温度升高而加快。如果浓度较低,可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。
5. 为了加快 BCA 法测定蛋白浓度的速度可以适当加热,但是切勿过热,否则易失效。
6. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。