ELISA检测试剂盒：原理、步骤和操作指南

  elisa检测试剂盒简称“酶联免疫试剂盒”简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。1971年– PeterPerlman和EvaEngvall开发了一种革命性的方法，称为ELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）。ELISA技术自七十年代初问世以来，发展十分迅速，目前广泛生物学和医学科学的许多领域。

  如今elisa检测试剂盒具有 灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性等受到科研好评。接下来上海通蔚带大家详细了解一下elisa实验原理及步骤。

  ELISA原理

  酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种使用酶标仪进行测定的免疫测定法，用于检测和定量生物分子，例如抗体、蛋白质、激素或肽，以及表征蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用。

  在ELISA实验中，用于实验的靶标（如抗原）固定在固体表面上，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶缀合抗体进行检测。通过与被酶催化的底物孵育来实现定量，从而产生可测量的副产物。

  由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。目前，elisa试剂盒检测方法有直接 ELISA、间接 ELISA、夹心 ELISA 和竞争 ELISA 等。

  直接ELISA法

  在直接ELISA中，抗原通过被动吸附直接固定在板（聚苯乙烯微孔板上）的表面，然后使用蛋白质（例如抑肽酶、卵清蛋白、BSA或任何其他动物蛋白）封闭微孔板，洗涤板并与一抗一起孵育。并使用HRP标记的一抗进行检测。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。

图1 直接ELISA

  由于elisa直接法步骤较少，适用于实验室工作流程的快速技术，同时还消除了二抗交叉反应，其缺点是灵敏度较低，成本较高。

  间接ELISA法

  间接ELISA法是在直接ELISA上改进的版本。在间接ELISA中，用于检测抗原的一抗是未偶联的。间接ELISA工作流程要涉及到两种类型抗体：一抗和二抗。取而代之的是，对一抗的宿主物种具有反应性的酶标二级抗体被用于检测一抗-抗原复合物（间接检测抗原）。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。

图2 间接ELISA

  间接ELISA的优点是成本较低、更加灵敏和灵活。然而，由于二抗的存在，检测过程中存在交叉反应的可能性。

  夹心ELISA法

夹心elisa法也叫“三明治法”，它需要使用匹配的抗体对，从而每种抗体对抗原上不同的非重叠表位具有特异性。首先将一种抗体，称为捕获抗体，包被在多孔微量滴定板的表面上，以促进靶抗原的固定。然后，第二种抗体（称为检测抗体）与捕获抗体-抗原复合物结合。最后，添加对检测抗体（而非捕获抗体）具有特异性的酶标记的第二抗体偶联物。

图3 夹心ELISA

  夹心ELISA具有最高的灵敏度，但其主要缺点是该过程所需的时间和费用。此外，寻找完美抗原抗体对的必要性也是该测定的限制。

  竞争ELISA法

  竞争elisa法检测样品中抗原特异性抗体的存在。将特异性抗体吸附于固相载体，加入待测抗原（标准品或样本）和生物素标记的检测抗原，二者竞争与固相抗体结合，然后加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，经过温育和彻底洗涤后加入显色底物。显色的深浅与样品中待测物质含量呈负相关。

  竞争elisa法不能用于经过任何程度稀释的样品，并且灵敏度较低。然而，它有许多优点，例如需要较少的样品纯化、较小的变异性以及分析样品中的一系列抗原。

  Elisa检测试剂盒组成及选择

  Elisa检测试剂盒组成

  Elisa检测试剂盒组成通常包含酶标板（Microplate）、标准品（Standard）、生物素标记的检测抗体(DetectedAntibody)、洗涤液(WashingBuffer)、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-Streptavidin)和显色底物(TMB)。

图4 elisa试剂盒组成

  Elisa检测试剂盒选择

  ELISA实验的成败，很大程度上取决于试剂盒的选择。面对众多品牌和种类，如何挑选合适的试剂盒呢？以下六个关键要素为你指明方向：

  1、供应种属

  一个ELISA试剂盒，多个种属，如果您需对不同物种的同一因子进行定量，建议优先寻找适用于多个种属的ELISA试剂盒，产品属性说明中会注明。Elis试剂盒种属有羊、鸡、鸭、人、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猪、犬、猴、马、牛等动物。

  2、明确样本的类型

  首先，您需要确定要检测的分析物的样本的类型。夹心ELISA最适合检测具有众多表位的巨大蛋白质，例如细胞因子。而竞争性ELISA主要用于检测小分子，例如半抗原。

  大多数市售ELISA试剂盒均已在培养物上清液和血清/血浆上进行了验证。正确阅读产品说明和说明非常重要。这确保了该试剂盒适合需要分析的样品。

  血浆样本的采集方式会极大地影响试剂盒类型的选择，进而影响所获得的结果。

  其他因素，例如溶血和样品制备中存在的脂质，可能会影响测定性能。在选择ELISA试剂盒之前，请确保充分注意这些因素。

  抗体类型

  您可以联系ELISA试剂盒供应商，获取有关试剂盒中使用的抗体类型的信息。它将帮助您确定它是单克隆抗体还是多克隆抗体。对于夹心ELISA，使用多克隆抗体捕获抗体和使用单克隆抗体检测抗体是有益的。

  线性和回收率实验

  您可以进行回收率和线性实验来监测ELISA试剂盒的性能。回收率测试分析样品基质中存在的变化对分析物检测的影响。据观察，如果该值较高，则恢复效果更好。

  稀释线性分析特定稀释剂中分析物的剂量响应线性。在理想情况下，所有稀释度的样品浓度都是相同的。

  很多时候，供应商在产品规格中给出了回收率和线性数据。除此之外，为了更清楚起见，还提到了其他关键参数，例如动态范围和灵敏度。不同制造商提供的ELISA试剂盒可能具有不同的数据参数。要选择合适的ELISA试剂盒，您可以分析所有数据参数，尤其是线性和回收率数据。

  系统所用检测范围

  ELISA中可用的各种检测系统包括比色法、发光法和荧光法。所有ELISA试剂盒都包括一定水平的分析物阻塞，包括应用酶标记和类似底物。选择合适的酶和相同的底物至关重要。此外，应谨慎选择交叉反应的酶底物、检测设备和微孔板。

  文献引用数

  好的产品，肯定经得起广大科研工作者的检验，ELISA试剂盒文献引用特别是高质量的SCI文章的引用是很多人都关心的问题，这是业界对产品认可的一个非常重要指标，而且对相关用户的科研有一定的借鉴作用。

  Elisa检测试剂盒基本步骤

  Elisa检测试剂盒基本步骤分包被、温育、洗涤和测量，详细如下：

  包被酶标板。将酶标板（微孔板）的孔位用特定的抗体或抗原进行包被，以便后续的检测。

  加样。将标准品或待测样品加入酶标板的孔中。这可能包括稀释样品和标准品。在加样时，应避免触及孔壁，并轻轻晃动混匀。

  温育。用封板膜封闭酶标板后，将其放置在特定温度下进行温育，以便样本与孔内的抗体或抗原充分反应。

  洗涤。温育后，用洗涤液彻底清洗孔位，去除未结合的物质。

  加酶标记抗体。向孔中加入与待测物质结合的酶标记抗体，形成免疫复合物。

  再次洗涤。去除未结合的酶标记抗体。

  显色和终止反应。加入底物溶液使酶标记抗体产生显色或荧光反应。随后加入停止液以停止反应。

  测量。使用酶标仪或荧光分析仪测量各孔的信号强度，根据信号强度确定待测物质的浓度。

  常用的ELISA检测方法

  在ELISA中，经常使用与特定抗原结合的标记抗体。因此，当将能够转化酶的底物添加到反应混合物中时，会引起溶液颜色的变化。使用检测方法来检测或分析信号。

  根据酶和底物的不同，ELISA检测中的检测方法差异很大。如今，还有许多ELISA试剂盒可让您轻松进行ELISA测定。但是，它不包含执行检测所需的通用试剂，例如tween-20、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、封闭缓冲液、洗涤缓冲液等。

  目前有许多检测方法可用于研究抗原抗体复合物之间的反应，例如比色法、荧光法、化学发光法和显色法。然而，下面介绍了其中最常见的三种。

  化学发光分析

  该技术利用过氧化物酶偶联的检测抗体，例如HRP和AP。基于鲁米诺的溶液用作形成反应产物的底物，发射光子，可以使用光度计读取光子。

  与其他检测方法相比，该技术具有超灵敏性，具有更宽的动态范围，甚至可以检测给定样品中最少量的分析物。

  显色测定

  显色法是ELISA检测方法中最常见的类型之一。它涉及使用辣根过氧化物酶(HRP-)或碱性磷酸酶(AP-)标记的抗体与显色底物（例如四甲基联苯胺(TMB)溶液）结合使用。

  该技术利用反应的吸光度来确定读数，用于比较样品或根据标准曲线检测感兴趣分子的浓度。

  荧光分析

  该技术将过氧化物酶偶联的检测抗体（例如HRP和AP）与暴露于某些光波长时发出荧光的荧光底物相结合。即使分析物浓度较高，信号也不会饱和，并提供更准确的结果。

  上述为大家介绍了elisa检测试剂盒原理和步骤，具体操作步骤要结合自己的实验需求和说明进行操作。由于ELISA方法具有敏感、快速、操作简便的优点，已经广泛用于检测中，对于科研，了解和操作ELISA实验是非常重要的。