免疫测定关键：一抗二抗如何选择？

  免疫测定在临床诊断和生物制药领域具有广泛的应用，可用于分析物的定量、定性和半定量分析。酶联免疫吸附测定 (ELISA) 和蛋白质印迹等免疫测定使用抗体来检测分析物，方法是响应抗体与其靶抗原的结合而产生可测量的信号。免疫测定通常需要两种类型的抗体：一抗和二抗。一抗特异性结合抗原，而二抗结合一抗。在这里，我们将讨论一抗和二抗在免疫测定中的工作原理、它们的生产方法以及如何选择用于免疫测定的抗体。关于什么是一抗二抗可以参考《免疫学检测：一抗和二抗简介》

  一抗和二抗如何发挥作用？

  免疫测定有 3 个主要组成部分：
  
  1、目标分析物：样品中检测到的抗原。
  
  2、抗体
  
    一抗：与目标抗原结合。
  
    二抗：与一抗结合。
  
  3、标记：与一抗或二抗缀合的标记，可产生可测量的信号

  直接与间接免疫测定

  免疫测定有两种类型：直接免疫测定和间接免疫测定（图 1）。在直接免疫测定中，标记物与一抗结合，并在抗原结合时产生可测量的信号（图 1，左）。因此，直接免疫测定是一种一步检测方法，不需要二抗进行检测。

  图 1.直接与间接免疫测定。直接免疫测定利用与信号分子缀合的一抗。间接免疫测定需要一抗来检测抗原，以及二抗与一抗结合并产生可测量的信号。在此示例中，与二抗缀合的 HRP 酶通过化学发光反应将 HRP 底物催化成可检测的光。

  间接免疫测定利用一抗和二抗进行抗原检测（图 1，右）。一抗与抗原结合，二抗与一抗结合并通过缀合标记促进检测。二抗有助于信号放大，因为多个二抗将与单个一抗结合。扩增过程可以实现低丰度抗原的可视化，并提高免疫测定的灵敏度。直接和间接免疫测定法各有优缺点，如 表 1 所示。

  免疫测定中使用的标记类型

  与抗体结合的标记会产生信号，从而可以定量和检测样品中的抗原。免疫测定中使用多种类型的标记，其选择取决于所进行测定的具体要求。一些常见的例子包括：

  酶：最常见的抗体标记类型。通常掺入的酶是辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。酶联抗体的免疫测定通过化学发光或比色检测方法进行分析。酶常用于蛋白质印迹、免疫组织化学 (IHC) 和 ELISA 等技术。

  荧光染料：荧光染料，例如：异硫氰酸荧光素 (FITC)、德克萨斯红和罗丹明。荧光染料在特定波长下的激发会产生不同且更长波长的发射。荧光染料广泛用于免疫荧光显微镜等技术。

  放射性同位素：用放射性同位素标记的抗体通过结合的抗体复合物发射的放射性进行测量。放射性同位素通常用于放射免疫测定 (RIA)，但由于非放射性替代品的出现，其使用量有所减少。

  生物素：生物素是一种可以与抗体结合的小分子。生物素可以用链霉亲和素缀合物（例如链霉亲和素-HRP）检测。

  一抗和二抗是如何产生的？

  一抗是通过体内和体外技术相结合产生的，例如杂交瘤生成、单 B 细胞测序和多克隆抗体测序。

  二抗是通过使用不同目标动物物种的抗体对宿主动物进行免疫而产生的（图 2）。例如，通过将兔抗体注射到山羊体内，产生山羊抗兔抗体，从而产生抗兔二抗。二抗生产的常见宿主物种包括山羊、驴和兔子。针对目标物种的混合抗体生成二抗，形成二抗的多克隆混合物，可识别宿主物种的重链 (HC) 或轻链 (LC)、Fab 和 Fc 区上的表位。减少二抗的交叉反应性可以通过用特定抗体片段免疫宿主来实现，从而产生针对特定区域的二抗，例如仅HC或LC，或Fab片段。从宿主中纯化后，抗体标记会与二抗结合。

图2.二抗的由来

  选择免疫测定的一抗和二抗

  选择用于免疫测定的抗体并非易事。选择正确的抗体时需要考虑几个因素，包括：

  1、确保一抗的种类与样品的种类不同，以避免与样品中的内源免疫球蛋白发生交叉反应。

  2、确保一抗能够识别样品物种中的目标蛋白，物种之间的交叉反应性由目标表位的序列同源性决定。

  3、确保一抗已被验证可用于所需的应用。

  4、选择针对一抗宿主物种产生的二抗。

  5、选择与正确标记结合的二抗。例如，对于免疫荧光，确保二抗具有所需波长的缀合荧光染料。

上文为大家介绍了免疫测定一抗和二抗，希望大家对抗体有个充分的认识，同时在实验过程选择正确的抗体。科研路上，抗体是您不可或缺的伙伴。 上海通蔚，专注于免疫学试剂研发与生产，为您提供高质量一抗、二抗，助力您的科研事业更上一层楼。