科研实验必备知识：一抗与二抗的区别

  一抗和二抗有什么区别？这是实验室新手经常问的问题。这里我们将从结合能力、用途与标记、来源、克隆性、预吸附五个角度来回答这个问题。

  结合能力

  抗体 (Ab) 广泛用于研究。根据其结合能力，抗体可分为两类：一抗和二抗。具体来说，一抗是与蛋白质或抗原 (Ag) 或您研究的任何物质结合的抗体，而二抗是与一抗结合的抗体。看下图1：

  图 1 主要抗体 VS二抗体

  如果您读过我们之前的文章什么是抗体？您将对抗体结构的良好了解，然后您会发现更容易理解一抗的 Fab 结构域与抗原结合并将其 Fc 结构域暴露给二抗，从而二抗的 Fab 结构域与一抗结合抗体的 Fc 结构域。

  由于给定物种中同类的所有抗体分子的 Fc 结构域都是相同的，因此一种类型的二抗能够与多种类型的一抗结合。例如，当在小鼠中产生的IgG类抗体用作一抗时，可以使用靶向小鼠IgG Fc结构域且不在小鼠中产生的抗体作为二抗。

  用途

  在免疫测定中，总是需要一抗来与靶抗原结合，但不一定使用二抗。我们以直接ELISA和间接ELISA为例。直接ELISA涉及直接标记，即一抗直接用酶标记进行酶促反应和信号检测，不需要二抗。间接ELISA不直接标记一抗，而是用酶标记二抗，如下图2所示。

  图 2 直接 ELISA 对比间接ELISA

  是否标记一抗（直接标记）或二抗（间接标记）取决于您的实验。无论是直接标记还是间接标记都有其优点和缺点。直接标记通常与简单的方案相关，可以节省时间和试剂，没有与二抗发生交叉反应的风险，但缺乏信号放大和灵活性，并可能导致高背景。间接标记涉及信号放大，由于同一二抗可以与多种一抗反应，因此非常灵活，但具有相对复杂的方案和交叉反应风险。

  来源

  抗体的来源是需要考虑的一个重要方面。一抗的宿主物种应与样品的物种不同，以避免二抗与样品免疫球蛋白发生交叉反应。此外，二抗的宿主物种应与一抗的宿主物种不同，因为二抗应针对一抗的物种。

  例如，如果您研究小鼠样本，您将需要在小鼠以外的动物中产生的一抗，例如在兔子中产生的一抗。然后，如果您使用针对小鼠的兔抗体作为一抗，您将需要在兔以外的动物中产生的二抗，例如在山羊中产生的二抗。

  为了能够检测目标抗原，二抗不仅应当对一抗的种类具有特异性，而且还应当对一抗的同种型具有特异性。例如，如果一抗是在兔体内产生的 IgG1 抗体，您将需要可以与兔 IgG1 抗体反应且不是在兔体内产生的二抗。

  克隆性

  一抗可以是单克隆抗体 (mAb) 或多克隆抗体 (pAb)。

  我们首先比较一下单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体仅识别抗原上的一个表位，而多克隆抗体识别抗原上的多个表位。因此，单克隆抗体和多克隆抗体具有不同的性质和用途。单克隆抗体具有高特异性和高重现性，与多克隆抗体相比，染色背景更少。然而，由于其高特异性，当抗原的化学处理改变目标表位时，单克隆抗体可能无法发挥作用。相比之下，多克隆抗体具有高亲和力，能够耐受抗原的微小变化，并且可以进行更稳健的检测。但多克隆抗体具有较高的批次间变异性，并且更有可能通过染色产生高背景。

  如果您的实验需要高特异性，使用单克隆抗体作为一抗可能是一个不错的选择。如果阳性信号较弱，请尝试多克隆抗体。由于多克隆抗体可识别多个表位，因此它们更有可能在免疫沉淀 (IP) 和染色质免疫沉淀 (ChIP) 中提供更好的结果。但如果你想探测抗原的特定域，多克隆抗体就没有用了，单克隆抗体作为一抗可能会更好。

  二抗可以是与一抗或其片段结合的单克隆抗体或多克隆抗体。二抗有不同形式。首先，二抗可以针对一抗的整个分子。例如，一抗通常是 IgG 同种型。然后，您需要抗 IgG H&L（重链和轻链）抗体作为二抗，它与 IgG 一抗的重链和轻链发生反应。此外，这种抗 IgG H&L 抗体还会与一抗物种的其他免疫球蛋白类别（例如 IgM 和 IgA）发生反应，因为给定物种中的所有免疫球蛋白都具有相同的轻链。其次，二抗可以对一抗的 Fab 区具有特异性。同样，这种形式的二抗也与重链和轻链反应，因此与具有相同轻链的其他免疫球蛋白类别反应。第三，二抗可以对一抗的 Fc 区具有特异性，这意味着它仅与重链反应。因此，该二抗仅与一类免疫球蛋白发生反应，例如 IgG 或 IgM。最后，二抗可以对一抗的轻链具有特异性，因此它将与具有相同轻链的所有免疫球蛋白类别发生反应。关于单克隆和多克隆，可以参考这篇文章《蛋白质免疫测定：认识多克隆抗体和单克隆抗体》

  5、预吸附

  二抗有时需要额外的纯化过程，称为预吸附，以提高特异性并最大限度地减少非特异性。在预吸附过程中，含有二抗的溶液通过含有来自潜在交叉反应物种（例如样品物种）的固定血清蛋白或免疫球蛋白的柱基质。通过这个过程，溶液中的非特异性抗体将被去除，而高度特异性的二抗被留下。例如，如果您使用小鼠组织，请选择已吸附小鼠血清或小鼠 IgG 的二抗。

  预吸附的二抗产生较少的非特异性结合，因此不太可能产生非特异性背景。当您在多重标记实验中测定蛋白质表达或研究富含免疫球蛋白的组织或细胞时，建议您使用预吸附二抗。

  综上所述，一抗和二抗之间存在一些差异。首先，一抗和二抗具有不同的结合能力。一抗与检测到的抗原结合，而二抗与一抗（通常是其 Fc 结构域）结合。其次，免疫分析中总是需要一抗，而二抗则不一定需要，这取决于实验方法（直接或间接标记）。第三，产生的一抗的物种与样品不是同一物种，产生的二抗的物种与一抗的物种来源不同。第四，一抗和二抗都可以是单克隆或多克隆，但克隆性的选择需要考虑不同的因素。最后，二抗有时需要预吸附，而一抗一般不需要。

  现在，您可能会更好地了解一抗和二抗之间的差异，并会发现更容易为您的实验选择正确的抗体。选择正确的抗体从来都不是一件容易的事。如果您选择的抗体不适合您的实验，您可能会浪费金钱、时间和宝贵的样品。如果您对一抗和二抗还有疑问，欢迎前来咨询。