分子生物学实验基础：掌握灭菌技术

  什么是灭菌？灭菌是指"杀死或完全除去所有生物体"，是分子生物学实验中最重要的操作之一。在培养大肠杆菌或无菌培养细胞/组织之前，请检查是否被培养的生物体以外的微生物（例如细菌、酵母、霉菌、支原体）污染以及细胞之间的污染（交叉污染）。使用的介质、试剂和设备应尽可能无菌。此外，从分子生物学的角度来看，灭菌预计具有使受污染的DNA和RNA变性和降解、以及使溶核酶失活的作用。通过灭菌杀死或除去微生物的状态称为“无菌”，维持这种状态称为无菌操作。

  

 
 灭菌方法大致可分为使用热的方法和不使用热的方法：

  最熟悉和可靠的方法是使用热量。例如，使用电烤箱的干热灭菌、用火焰加热金属等的火焰灭菌、以及使用高压蒸汽的高压灭菌器（高压蒸汽灭菌）。

  RNase对试剂和设备的污染是涉及RNA的实验中的一个问题，因此需要提供无RNase的环境，这意味着RNase被完全失活并去除。干热灭菌和火焰灭菌可以可靠地去除 RNase，但要小心，因为高压灭菌可能会留下少量 RNase。

  另一方面，使用膜过滤器过滤灭菌是不使用加热而物理去除微生物的常用方法，但由于核酸和病毒会通过过滤器，因此必须小心。此外，作为超出实验室水平的方法，还有伽马射线灭菌和气体灭菌（环氧乙烷气体），用于对一次性塑料器械和医院进行灭菌。

  本文对实验室常用的灭菌方法干热灭菌、高压灭菌、火焰灭菌、过滤灭菌进行概述、特点及注意事项。

  干热灭菌

  干热灭菌是使用电烘箱的灭菌方法，推荐加热条件为160-170℃120分钟、170-180℃60分钟、180-190℃30分钟。为了彻底去除 RNase，加热 2-3 小时是安全的。

  用于对玻璃、金属仪器等可加热至高温的物品以及不宜与蒸汽接触的物品进行灭菌。瓶盖通常不能干热灭菌，但可以使用杜兰瓶红色瓶盖。

  将移液器放入移液器罐中，用铝箔包裹玻璃器皿、研钵、搅拌棒、抹刀等，然后放入烤箱中。此时，请务必将设备彻底干燥后再插入，以免出现水滴。另外，请确保在烤箱中留出足够的空间，以便热量均匀地施加到电器上。加热器附近的金属部件可能会比设定温度更热，因此请避免在附近放置棉塞等易燃物品。打开开关并测量箱体达到指定温度后的时间。灭菌完成后，关闭加热器并等待冰箱内部充分冷却后再取出物品。

  高压灭菌器灭菌

  高压灭菌器（高压蒸汽灭菌器/高压灭菌器）是一种结构类似于巨大压力锅的设备，它可以通过施加压力来提高水的沸点，并利用高温蒸汽进行热处理。这种热处理有时称为高压釜。水的沸点在1个大气压下为100°C，但在2个大气压下则变为约121°C。典型的高压灭菌包括在121℃下热处理15至20分钟。

  使用它不需要特殊的资格或许可证，但由于它被归类为小型压力容器，因此请小心处理。

  可高压灭菌的仪器和溶液在高达 130°C 的温度下保持稳定，并且可以受潮。主要用于对干热灭菌温度（160°C或更高）敏感的橡胶仪器、玻璃仪器、耐热塑料仪器、金属、耐高压灭菌介质以及不发生热变性的试剂的灭菌。水溶液可以高压灭菌，但有机溶剂不应高压灭菌。

  为防止高压灭菌器内部污染，建议用于废物处理的高压灭菌器与用于灭菌的高压灭菌器分开安装，即使使用相同的设备，废物处理和灭菌也应分开进行。经常清洁用于灭菌的高压灭菌器，并且当有液体可能溢出到灭菌室时务必进行清洁。

  高压灭菌器灭菌程序

  首先，加入自来水，直到沥水板（底部有孔的圆盘）稍微浸没。此时，如果添加超纯水，电流就不容易流动，防干烧机制可能会被激活。将仪器和试剂从上方放入篮子中。将盖子放在正确的位置并拧紧手柄以将其固定。确保安全阀的重量放置正确，关闭排气旋塞，设定定时器，然后开始加热。

  随着设备内部温度逐渐升高，蒸汽会从排气软管中冒出，但一段时间后阀门会自动关闭，内部压力会增加。若有蒸汽泄漏，将盖子稍微拧紧，若仍不停止，则停止操作。运行中请勿移动设备，若安全阀的重物因振动而脱落，请用镊子等夹起重物，重新放置。

  经过设定时间后，温度和内部压力逐渐降低，在100℃左右排气阀打开。当压力达到常压且温度降至100℃以下时，打开盖子，取出仪器和试剂，直至其冷却到可以容纳的程度。

  用于精确测量少量量的微量移液器吸头应在使用前在高压灭菌器中消毒并干燥。

  通过高压灭菌对液体进行灭菌时

  将液体放入玻璃容器中并进行高压灭菌。此时，您可以在打开（松开）盖子的情况下进行操作，也可以在关闭盖子的情况下进行操作。

  如果盖子打开，任何普通耐热玻璃容器都可以使用，但存在污染样品的潜在风险，以及挥发性物质（盐酸、乙酸、氨、碳酸、缺点是一些盐（例如，盐）通过蒸发而损失。如果用铝箔盖住容器的盖子，加热后即可关闭，无需直接接触盖子。如果在瓶子很热时盖上盖子，瓶子内部会形成负压，盖子将无法打开，因此请在盖上盖子之前让其充分冷却。

  液体培养基的灭菌也在开放系统中完成。盖子使用铝箔、硅胶泡沫塞、棉塞以及试剂瓶上的活盖。基本上，按照与普通溶液相同的方式进行，高压灭菌后，确保盖子盖紧，然后存放在阴凉、黑暗的地方。

  对琼脂培养基进行高压灭菌时，添加粉末状的琼脂，然后将琼脂溶解在高压灭菌器中。高压灭菌后，浓稠的琼脂溶液会沉淀在底部，因此用手摇晃使其均匀。一旦容器冷却至 45-55°C，根据需要无菌添加不耐热添加剂（抗生素、IPTG 等）和高压灭菌后添加的盐（镁盐、钙盐、磷酸盐等）。如果不立即使用，请在 45-55°C 下保温。

  对容器进行高压灭菌时，请务必使用压力瓶。带蓝色瓶盖（或同等瓶盖）的杜兰德瓶是不错的选择。但如果大于1升，则需要小心，因为它很容易损坏。向瓶子中添加的液体不要超过规定量，添加碳酸氢钠时，将液体量限制在瓶子的一半左右。

  对溶液进行高压灭菌时，应注意以下几点，防止发生事故。首先，不要向锅中注入超过其容量35%的液体。锅在操作过程中可能会爆炸。另外，高压灭菌后，不要强行排气，让压力和温度自然下降，待充分冷却后再取出。当溶液温度超过100℃时，如果打开、关闭盖子或振动，可能会发生暴沸。特别是如果含有琼脂，则很难冷却，更容易发生这种事故。

  火焰灭菌

  使用煤气燃烧器、酒精灯或电燃烧器，通过火焰加热，灰化并分解设备表面的有机物。这种灭菌方法对无菌操作期间可能粘附在手、物体或接触空气的区域上的微生物进行灭菌，对用于操纵细菌的铂环和铂丝尖端进行灭菌，并使用不含 RNase 的抹刀和镊子。它用于诸如建立国家等目的。它主要用于金属消毒，但也可用于玻璃和聚四氟乙烯。

  火焰顶部温度高（氧化焰），底部温度低（还原焰），所以进行火焰灭菌时，采用顶部氧化焰。

  请注意，如果在消毒酒精蒸发之前喷洒消毒酒精并进行火焰消毒，可能会引起火灾。另外，小心不要因接触火焰灭菌区域而被烧伤，或将热移液管插入细胞悬浮液而损坏细胞。

  过滤除菌（过滤除菌）

  过滤灭菌适用于少量液体、不耐热溶液、生物聚合物和有机溶剂的灭菌。

  过滤材料包括尼龙、PVDF、PES和醋酸纤维素，根据用途和样品根据亲水性和有机物吸附性能进行选择。0.4至0.8μm的孔径足以去除不溶性物质，但如果要去除微生物，请使用0.22μm或更小的孔径。另外，去除支原体时，需要使用孔径为0.1μm的过滤器。

  过滤灭菌在超净工作台上进行。使用注射器型时，首先将样品吸入注射器中。此时，也吸入少量空气。打开装有过滤器的夹套，将注射器插入过滤器，利用活塞推出液体，过滤样品。将滤液转移至无菌容器中。当所有液体被推出时，空气留在末端，但当空气接触到过滤器时，它会锁定并且无法进一步被推入。如果您可以进一步推动，则表明过滤器存在泄漏，因此请尝试使用新过滤器再次过滤。

  上面我们已经解释了四种灭菌操作。如果程序不正确或不小心，灭菌操作可能会导致污染和事故。当你反复做、习惯了之后，特别容易失败，所以一定要记住初衷，认真做。