PCR实验室科学 | 如何扩增所需的目标片段

  1983年，美国生物化学家卡里·穆利斯(Cary Mullis)提出了核酸体外扩增的想法，并于1985年发明了聚合酶链式反应(PCR)过程，从而诞生了PCR技术。1988年，Saiki等人成功地使用从植物中分离出来的耐热DNA聚合酶自动扩增DNA DNA聚合酶使PCR变得更加方便，这使其成为一种通用的分子生物学技术。

  在传统PCR技术在分子生物学各个领域广泛应用时，常常出现样本量小、样本珍贵、非特异性扩增等现象。非特异性扩增可能由以下原因引起：常规设备DNA聚合酶的最佳温度为72℃，此时酶活性最高，酶活性下降。此外，DNA聚合酶在低温下被激活，导致错误的引物序列延伸并形成引物二聚体。热启动高保真酶也会出现非特异性扩增，主要是由于PCR条件（Mg2+、退火温度、循环次数），ETC）。非特异性可能导致：目标扩增子产量低、目标扩增子灵敏度降低、下游应用效率低。

  今天上海通蔚将带大家科学讨论PCR如何放大所需的目标片段，通常方法如下：

  1、直接PCR

  直接PCR是指直接从样品中扩增靶DNA，无需分离或纯化核酸。

  在高温变性步骤中，细胞或组织等样品在特殊配制的缓冲液中裂解，然后释放DNA。直接PCR简化了工作流程并减少了操作步骤。从而防止纯化步骤中DNA丢失。菌落PCR鉴定是现代分子生物学实验室直接PCR最典型的应用。简单处理或稀释后的样品可直接进行PCR。

  2、梯度PCR

  梯度PCR和降落PCR都优化反应体系的退火温度，但原理不同。

  梯度PCR用于不清楚退火温度的情况。为确定最佳退火温度，多管PCR同时运行PCR仪一台（需要支持设置梯度退火温度的PCR仪）。将每个管放置在仪器内的不同列或行中，并单独运行PCR（例如，对于50-60°C的温度范围，将6个管放置在50°C、52°C和54°C）C).C、56°C)、58°C和60°C，分别)。最后确定最佳退火温度，并在此退火温度下进行常规PCR扩增。

  3、降落PCR技术

  PCR系统的许多组件如引物、模板、Mg2+、dNTP等都可能导致实验结果不准确。可能发生。对于复杂的基因组DNA模板，传统PCR常常伴随非特异性扩增，无法产生理想的目标产物。为了解决PCR中非特异性扩增的问题，Dong等人。1991年，他发明了降落PCR（TD-PCR）技术。

  降落PCR与梯度PCR相比具有以下优点：首先，选择合适的梯度PCR退火温度需要多次反应或多管反应。其次，即使通过多次实验确定了最佳退火温度，如果更换其他PCR设备并进行相同的扩增，最佳退火温度也可能会发生变化。这时，需要重新确定最佳退火温度。而降落PCR只需一次反应即可获得良好的扩增效果，并且避免了对每对引物最佳复性温度的优化和确定。此外，降落PCR显着缓解了仪器性能对扩增效果的限制。

  原则

  PCR中的退火温度会影响扩增结果。随着退火温度升高，扩增特异性增加，但扩增效率降低。在降落PCR开始时，进行高温扩增以获得特异性扩增产物。目的基因丰度增加后，降低扩增温度可提高扩增效率。将退火温度降低至发生非特异性扩增的水平可为特异性扩增产物提供几何优势。其余反应中的非特异性位点由于丰度较低而无法与特异性位点竞争，获得单一主要扩增产物。

  退火温度设定

  通常，降落PCR的退火温度范围为高于Tm值5°C至低于Tm值约10°C，最高可达15°C。在每个温度下循环1至2次，然后在较低的退火温度下循环10次。

  应用

  Touchdown PCR适用于经常更换引物的实验。Touchdown PCR可以让您快速、特异地获得所需的扩增片段，而无需知道Tm值，也无需费力确定最佳Tm值。现在许多PCR仪器都包含设置降落PCR的程序，该程序广泛用于研究。

  4、巢式PCR

  巢式PCR是PCR的一种变体。使用两对PCR引物对（而不是单个引物）来扩增特定片段。第一对PCR引物扩增片段，与传统PCR类似。第二对引物是嵌套引物（因为它们位于或嵌套在第一个片段内），a>结合在第一个扩增子内并特异性扩增第一个扩增子内的DNA片段。

  优势

  如果在第一次扩增中产生了错误的片段，该区域在第二轮中被第二对引物对扩增的概率非常低。。因此，巢式PCR具有较高的扩增特异性。

  实验过程

  步骤1：

         第一对引物（以绿色显示）与DNA目标模板结合。由于特异性不足，它还可能与具有相似结合位点的其他片段结合并扩增靶标。

第二步：使用第二对橙色引物与第一步扩增的目标片段结合，进行第二次扩增。这些引物嵌套在第一个PCR产物中，因此非特异性扩增的PCR产物包含两个引物对。它不太可能包含结合位点。这可以防止第二组引物扩增非目标片段。这种嵌套式PCR扩增确保了第二次PCR扩增的PCR产物很少或没有受到来自替代引物目标序列的非特异性扩增PCR产物的污染。

上述是PCR扩增实验，为大家介绍实现扩增的一些方法，这些方法是我在此领域为大家总结的经验，希望大家在实验过程可以根据自身的需求进行选择。上海通蔚有PCR试剂盒，如果您需要了解更多PCR试剂盒，欢迎咨询。