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【通蔚生物】:人谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒的操作步骤

发布时间:2022-05-26     发布作者:上海通蔚生物


人谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人谷胱甘肽(GSH)的含量。

实验原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA),往预先包被人谷胱甘肽(GSH)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤,用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色,颜色的深浅和样品中的人谷胱甘肽(GSH)呈正相关,用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

样本处理及要求
1.血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
2.血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
3.组织匀浆:用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎,将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录,推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨,为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融,最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。
4.细胞培养物上清或其它生物标本:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。


操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
3.样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。
4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线,并得到直线回归方程,将样品的OD值代入方程,计算出样品的浓度。