什么是实时 PCR (qPCR)？一文了解工作原理

  核酸扩增和检测技术是当今生物研究中最有价值的工具之一。生命科学各个领域（基础研究、生物技术、医学、法医学、诊断学等）的科学家在广泛的应用中利用这些方法。对于某些应用，定性核酸检测就足够了。然而，其他应用则需要定量分析。实时荧光定量PCR可用于定性和定量分析；为您的应用选择最佳方法需要对该技术有广泛的了解。上海通蔚蔚您介绍实时 PCR、反转录定量 PCR 技术以及 Bio-Rad 为这些技术提供的仪器选择。它还提供了 RNA 分离步骤的提示，例如样品收集、RNA 提取以及分析 RNA 的质量和数量。

  页面内容

  什么是实时 PCR？

  实时 PCR/qPCR 检测的应用

  实时荧光定量 PCR 是如何工作的？

  RNA分离

  逆转录定量 PCR (RT-qPCR)

  qPCR/实时 PCR 仪器

  什么是实时 PCR？

  在传统 PCR 中，扩增的 DNA 产物或扩增子在终点分析中进行检测。在实时 PCR 中，随着反应的进行，实时测量扩增产物的积累，并在每个循环后进行产物定量。

  下面的 qPCR 工作流程描述了实时 PCR 的步骤。首先，使用 PCR 试剂和独特或定制引物设置扩增反应。然后在实时 PCR 仪器中运行反应，并通过专有仪器软件分析收集的数据。

  PCR 产物的实时检测是通过在每个反应孔中包含荧光报告分子来实现的，随着产物 DNA 量的增加，荧光报告分子会产生增强的荧光。用于此目的的荧光化学包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异性引物或探针。配备荧光检测模块的专用热循环仪用于在扩增发生时监测荧光信号。测得的荧光与扩增子总量成正比；荧光随时间的变化用于计算每个循环中产生的扩增子的量。

  与 PCR 相比，实时 PCR 的主要优点是，实时 PCR 允许您在宽动态范围内准确且高灵敏度地确定模板 DNA（扩增目标序列）的初始拷贝数。实时 PCR 结果可以是定性的（序列是否存在）或定量的（拷贝数）。因此，定量实时 PCR 也称为 qPCR 分析。相比之下，PCR 至多是半定量的。此外，无需凝胶电泳即可评估实时 qPCR 数据，从而减少实验时间并提高通量。最后，由于在统一的闭管 qPCR 系统中运行实时 qPCR 反应并评估数据，因此减少了污染的机会，并且在 qPCR 分析中消除了扩增后操作的需要。

  实时 PCR/qPCR 检测的应用

  实时 PCR/qPCR 检测已成为快速、灵敏地测定和定量各种生物样品中核酸的首选工具，具有多种应用，例如基因表达分析、食品中转基因生物的检测和癌症表型分析。

  在研究实验室中，qPCR 检测广泛用于定量测量转化细胞系中的基因拷贝数（基因剂量）或突变基因的存在。与逆转录 PCR (RT-PCR) 相结合，qPCR 检测可通过测量细胞中的变化来精确定量基因表达的变化，例如，响应不同环境条件或药物治疗的表达增加或减少。 mRNA 水平。

  实时荧光定量 PCR 是如何工作的？

  为了了解实时 PCR 的工作原理，我们使用典型的扩增图来说明 qPCR 分析（图 1）。在此图中，x 轴显示 PCR 循环数，y 轴显示扩增反应的荧光（与管中扩增产物的量成正比）。

  扩增图显示两个阶段，指数阶段，随后是非指数平台阶段。在指数生长期，PCR 产物的量在每个循环中大约翻倍。然而，随着反应的进行，反应组分被消耗，并且最终一种或多种组分变得有限。此时，反应减慢并进入平台期（图 1 中的循环 28-40）。

  最初，荧光保持在背景水平，并且即使产物呈指数累积，也无法检测到荧光的增加（循环 1-18，图 1）。最终，积累足够的扩增产物以产生可检测的荧光信号。发生这种情况的循环数称为定量循环或 C q。由于 C q值是在试剂不受限制的指数期测量的，因此实时 qPCR 可用于基于描述反应进程的已知指数函数可靠且准确地计算反应中存在的模板的初始量。

  反应的C q主要由扩增反应开始时存在的模板量决定。如果反应开始时存在大量模板，则需要相对较少的扩增循环来积累足够的产物以产生高于背景的荧光信号。因此，反应的 C q较低或较早。相反，如果反应开始时存在少量模板，则需要更多的扩增循环才能使荧光信号升至背景之上。因此，反应将具有高或晚的 C q。这种关系构成了实时 PCR 定量方面的基础。

  RNA分离

  样品采集

  对于RNA 分离 和基因表达定量，样品材料应尽可能均匀。如果您的组织样本由许多不同的细胞类型组成，那么精确定位靶基因的表达模式可能会很困难。如果您有异质样品，请使用可用于分离和分离特定细胞类型的多种方法之一，例如组织解剖、针活检和激光捕获显微切割。然后可以使用收集的细胞来获取 RNA 样本。

  RNA 提取

  总 RNA 或 Poly(A+) RNA 可用于大多数实时 RT-qPCR 应用。使用 RNA 时的一项关键考虑因素是消除解决方案、耗材和实验室器具中的 RNase。您可以购买即用型无 RNase 溶液，也可以用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理您的溶液，然后进行高压灭菌。实验室器具上的 RNase 也可以通过 DEPC 处理或在 250°C 下烘烤 3 小时来灭活。

  制备的 RNA 样品可能需要 DNase 处理，以防止任何污染基因组 DNA 的潜在扩增，这可能导致高估 mRNA 的拷贝数。然而，当起始材料有限时，DNA酶处理可能是不可取的，因为额外的操作可能会导致RNA损失。通过设计转录特异性引物，例如跨剪接点或跨剪接点扩增的引物，可以防止潜在污染的基因组DNA的扩增。

  分析核酸数量和质量

  准确的核酸定量对于基因表达分析至关重要，特别是当使用总 RNA 量来标准化靶基因表达时。RNA浓度和纯度通常通过测量 260 nm 和 280 nm 处的 UV 吸光度比率来确定。

  逆转录定量 PCR (RT-qPCR)

  有两种方法可用于通过 RT-qPCR 定量基因表达：两步 RT-qPCR 和一步 RT-qPCR。在这两种情况下，RNA 都会逆转录为 cDNA，然后将 cDNA 用作 qPCR 扩增的模板。一步和两步是指RT和实时PCR扩增是在同一管还是分开的管中进行。在两步法中，RNA 首先在使用逆转录酶的反应中转录成 cDNA。然后将所得 cDNA 的等分试样用作多个 qPCR 反应的模板。在一步法中，RT 和 qPCR 在同一管中进行。

  qPCR/实时 PCR 仪器

  实时 PCR 检测系统由配备光学检测模块的热循环仪组成，用于测量每个扩增循环期间荧光团与目标序列结合时产生的荧光信号。Bio-Rad 实时 PCR 检测系统 配备带有可互换模块的热循环仪，用于荧光团的单重和多重检测以及固定的实时 PCR 单元。所有 qPCR 系统均具有热梯度功能。