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021-54845833/15800441009
测定意义
辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
测定原理
分别用酸性和碱性提取液提取样本中NAD+和NADH，在1-mPMS作用下，WST-8可与NADH 反应，产生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰，而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用WST-8检测。
需自备的仪器和用品
酶标仪、台式离心机、移液器、水浴锅、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
测定步骤
1、酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。
2、加样表(在96孔板中按下表依次加样）：
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试剂名称（μL） |
测定管 |
空白管 |
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样本 |
20 |
- |
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蒸馏水 |
- |
20 |
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试剂一 |
160 |
160 |
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试剂二 |
10 |
10 |
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试剂三 |
10 |
10 |
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充分混匀，37℃孵育30min后于450nm处测定吸光值A , 计算△A=A测定管-A空白管。 |
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预实验的意义
比色法检测试剂盒预实验非常重要
1、确定该试剂盒是否适合客户的样本检测，以免造成试剂盒和样本的浪费（比如低表达处理的样本）；
2、熟悉生化试剂盒的操作流程，尤其是初次使用生化试剂盒测定；
3、确定样本的处理方法及稀释倍数是否合适；
4、了解实验过程中可能出现的实验现象或问题，以便于及时作出调整；
5、通过3 - 5组预实验，判断试剂盒对于样本的最佳适应稀释浓度范围，指导实验样本稀释比例。
注意
正式测定前务必取 3 - 5 个预期差异较大的样本做预测定。
