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辅酶2 NADP(H)含量(WST-8法)检测试剂盒
测定意义
测定意义
辅酶Ⅱ NADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP （NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。 NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重 要调控作用。
测定原理
分别用提取液提取样品中NADP+和NADPH。在1-mPMS作用下，WST-8可与NADPH 反应，产生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰，而NADP+可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH，进一步采用 WST-8 检测。
需自备的仪器和用品
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸馏水。
测定步骤
测定步骤
1、酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm。
2、工作液的配制：临用前按照样本数量，按以下比例配制工作液。
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试剂名称（μL） |
工作液 |
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试剂一 |
100 |
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试剂二 |
50 |
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试剂三 |
10 |
3、样本测定
按下表在96孔板中加入如下试剂
预实验的意义
按下表在96孔板中加入如下试剂
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试剂名称（μL） |
测定管 |
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样本 |
50 |
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测定工作液 |
150 |
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充分混匀，于450nm下测定吸光值A1，37℃避光孵育30min，450nm下测定吸光值A2，△A=A2-A1。 |
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预实验的意义
比色法检测试剂盒预实验非常重要
1、确定该试剂盒是否适合客户的样本检测，以免造成试剂盒和样本的浪费（比如低表达处理的样本）；
2、熟悉生化试剂盒的操作流程，尤其是初次使用生化试剂盒测定；
3、确定样本的处理方法及稀释倍数是否合适；
4、了解实验过程中可能出现的实验现象或问题，以便于及时作出调整；
5、通过3 - 5组预实验，判断试剂盒对于样本的最佳适应稀释浓度范围，指导实验样本稀释比例。
注意
注意
正式测定前务必取 3 - 5 个预期差异较大的样本做预测定。
