HA抗体亲和凝胶

纯化，免疫沉淀

1. 纯化

1.1 填料准备：取适量的凝胶加入层析柱中，流干保存液，加入5倍柱体积（凝胶体积）的平衡液清洗。

1.2 加入样品溶液，室温震荡孵育30分钟(不能用磁力搅拌器搅拌)，确保填料与样品溶液充分混合。

1.3 孵育完毕后，将填料混合液离心：1000g，5分钟，或过滤收集填料。

1.4 将填料装入层析柱中，用平衡液清洗4-5次，直至紫外检测值稳定。

1.5 洗脱 1.5.1 酸性洗脱：加入5倍柱体积的酸性洗脱液，收集管中预先加好中和液50 μl中和液/ml洗脱液，分管收集。 注意：酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡，Anti-HA Affinity gel在洗脱液中不要超过20分钟。

1.5.2 竞争性洗脱：使用5倍柱体积的竞争性洗脱液HA多肽0.5 mg/ml洗脱，30℃孵育10-15分钟，重复1-2次，分管收集。

1.6 使用3倍柱体积的酸性洗脱液再生凝胶，然后用平衡液平衡至中性。 1.7 加入保存液，2-8℃保存。

2. 免疫沉淀 2.1 取20-100μl的Anti-HA Affinity gel加入到2ml 离心管中，离心：5000g，30秒，弃去上清。

2.2 加入0.5ml平衡液，悬浮填料，离心：5000g，30秒，弃去上清。重复一次。

2.3 加入200-1000μl样品裂解液，与填料混合均匀，置于旋转混合仪上轻轻旋转离心管，使样品和填料充分接触并吸附，室温1小时。混匀后离心：5000g，30秒，吸取上清，留样检测。

2.4 洗涤：加入0.5ml的洗涤液，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，离心：5000g，30秒，弃去上清。重复3次。

2.5 变性洗脱：加入5μl 5X变性洗脱液，沸水浴煮沸5分钟。离心：5000g，30秒，吸取上清进行SDS-PAGE电泳检测。

注意：变性洗脱液中含有SDS，会使偶联的HA抗体变性，洗脱后的凝胶不可重复使用。