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    小鼠Flag标签(Flag-tag)ELISA试剂盒

    规格：
    价格：￥
    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目录号 : TW7409
    • 应用 : 仅限于科研使用
    • 英文名 ：Mouse Flag-tag ELISA KIT
    • 货期 : 现货
    • 灵敏度 ：0.06ng/mL
    • 规格 ：48T/96T
    • 检测范围 ：0.125 ~ 8ng/ml
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简介
FLAG标签，或FLAG八肽，或FLAG表位，是一种多肽蛋白质标签，可以用重组DNA技术添加到蛋白质中，其序列图案为DYKDDDDK（其中D=天冬氨酸，Y=酪氨酸，K=赖氨酸），它是最特异的标签之一，是一种通用种属工抗原，已经开发出特异的、高亲和力的单克隆抗体，因此可用于亲和层析法的蛋白质纯化，也可用于定位活细胞内的蛋白质，它已被用于分离重组的、过量表达的蛋白和宿主生物体表达的野生型蛋白，它还可用于分离具有多个亚单位的蛋白质复合物，因为其温和的纯化过程往往不会破坏这种复合物，它已被用于获得足够纯度和质量的蛋白质，以通过X射线晶体学进行三维结构测定，FLAG标签可用于许多需要抗体识别的不同检测中，如果没有针对某一特定蛋白的抗体，在蛋白上添加FLAG标记，就可以用针对FLAG序列的抗体来研究该蛋白，例如通过免疫荧光、免疫沉淀或通过SDS PAGE蛋白电泳和Western印迹检测进行细胞定位研究，从N端到C端的FLAG标签的肽序列是，DYKDDDDK（1012Da），此外，它还可以串联使用，常见的是3xFLAG肽，DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK（最后一个标签编码一个肠激酶裂解位点），它可以与蛋白质的C端或N端融合，或插入到蛋白质内，一些市售的抗体（如 M1/4E11）只有在N端出现时才能识别该表位，然而，其他可用的抗体（如M2）则对位置不敏感，FLAG标签中的酪氨酸残基可以被硫酸化，这可能会影响抗体对FLAG表位的识别，FLAG标签可以与其他亲和力标签一起使用，例如多组氨酸标签（His标签）、HA标签或myc标签。
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物Flag-tag，清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中Flag-tag的浓度。
需要的其他材料
1.  酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；
2.  移液器及枪头；
3.  蒸馏水或去离子水；
4.  100-1000 mL刻度量筒；
5.  洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；
6.  水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；
7.  用于稀释标准品和样品的试管。
样品保存
样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
试剂准备工作
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置

试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从160ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至8ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的8ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将8ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为: 8ng/mL、 4ng/mL、 2ng/mL、 1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.25ng/mL、 0.125ng/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。

小鼠(Flag-tag) ELISA试剂盒

抗体工作液配置
使用前10分钟，将100×生物素化抗体于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液，根据所需用量当日配置当日使用。
酶结合物工作液配置
使用前10分钟，将100×SA-HRP溶液于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。
备 注：如待测样本中Flag-tag浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数。
结果的计算
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。
若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
示例数据
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。

标准品浓度(ng/mL)

8

4

2

1

0.5

0.25

0.125

0

OD值

2.553

1.616

1.08

0.653

0.385

0.269

0.189

0.061

校正OD值

2.492

1.555

1.019

0.592

0.324

0.208

0.128

0








下图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果

小鼠(Flag-tag) ELISA试剂盒

重复性
板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。
灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.06ng/mL。
特异性
该试剂盒测定可识别重组小鼠Flag-tag。
其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。