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随机引物法DNA探针标记试剂盒
产品及特点
本产品是基于Feinberg和Vogelstein发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA探针标记试剂盒，标记过程由双链DNA热变性、随机引物与单链DNA结合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探针并掺入标记的核苷酸三步组成，可用下面的示意图表示：
产品及特点
本产品是基于Feinberg和Vogelstein发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA探针标记试剂盒，标记过程由双链DNA热变性、随机引物与单链DNA结合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探针并掺入标记的核苷酸三步组成，可用下面的示意图表示：
本产品对Feinberg和Vogelstein经典方法进行了改良，它具有下列特点：
1. 提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了标记反应的可重复性。
2. 使用无外切活性的Klenow exo- DNA聚合酶，已标记DNA探针不会被酶降解，探针产量更高。
3. 快速，快1小时即可完成标记反应。
4. 得到的DNA探针比活性高（如果是同位素，可以达到10E9 cpm/ug DNA）。
5. 所需模版DNA量少，模板可以是线状或环状的、也可以是单链或双链的，但长度必须在100 bp以上。
6. 得到的探针长度一般在200-400 nt之间（如果模板长度在1kb以上），可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
7. 本产品足够5次标记实验。
8. 本产品只能用于科研。
规格及成分
规格及成分
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成分 |
规格 |
包装 |
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10×随机引物标记反应液(自备标记核苷酸型) |
10uL |
0.5mL绿盖管 |
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Klenow exo-聚合酶 |
5uL |
0.5mL红盖管 |
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dATP，2 mM |
10uL |
0.5mL白盖管 |
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dTTP，2 mM |
10uL |
0.5mL紫盖管 |
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dGTP，2 mM |
10uL |
0.5mL蓝色管 |
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dCTP，2 mM |
10uL |
0.5mL黄盖管 |
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标记专用随机引物溶液 |
10uL |
0.5mL橙盖管 |
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超纯水 |
1mL |
1.5mL本色管 |
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使用手册 |
1份 |
无 |
使用方法
注 意：随机引物标记效率跟起始模板量和保温时间相关，杂交时需要探针DNA必须达到一定的浓度，其中探针/模板比越高，没有标记的模板DNA对杂交的竞争性抑制越低。用户在实验前可以根据下表选择合适的起始模板量和保温时间：
注 意：非同位素标记基团（如生物素和地高辛）疏水性强，易与塑料离心管表面非特异性结合，所以要硅化塑料离心管。模板DNA并非越多越好，否则没有标记的模板DNA在杂交时会竞争性地抑制标记DNA跟靶分子的杂交，反而降低杂交信号强度。
1. 沸水浴10分钟，或在PCR仪上100℃加热10分钟彻底变性模板DNA，结束后需要立即放冰上待用。不能缓慢降温，否则变性的模板DNA单链又会杂交形成双链。
2. 离心数秒使所有液体集中在管底，如果标记物为dTTP则加入除dTTP之外的三种核苷酸（dATP、dGTP、dCTP）各1 uL（共3uL，浓度均为2mM），自备的dTTP/标记dUTP混合物1uL，加入1 uL Klenow exo聚合酶。如果标记物为dCTP则加入除dCTP之外的三种核苷酸（dATP、dGTP、dTTP）各1 uL，以此类推。
注：dTTP/标记dUTP混合物中dTTP和标记dUTP的总浓度必须达到2mM，dTTP与生物素标记dUTP或地高辛标记的dUTP的比例在65：35为。但如果使用自备的其他标记核苷酸，如fluorescein、hydroxycoumarin、resorufin和aminoallyl标记的dUTP，则用户需要自己摸索其与dTTP之间的比例，如果使用32P标记的dUTP，则比活为3000Ci/mmol，浓度为好为10uCi/uL，并且不需要加入dTTP。
3. 轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，离心数秒使所有液体集中在管底。
4. 37℃保温1-20小时。反应结束后加热100℃ 5分钟使DNA聚合酶变性，同时使DNA探针变性成单链，然后立即冰上冷冻。不能缓慢降温，否则变性的模板DNA单链又会杂交形成双链。
5. 变性后的标记反应液可以放-20℃长期保存，也可以直接加入到杂交反应液中进行杂交。如果电泳检测，标记产物将是弥散状态。
注 意：本方法标记核苷酸掺入率极高，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化，不要用酚抽提法纯化非同位素标记的DNA探针，因为这些标记分子（如生物素或地高辛等）疏水性强，能使标记的DNA进入疏水的有机相而丢失。只能选择乙醇直接沉淀或Sephadex G50过柱回收（需另购柱式探针纯化试剂盒）。对比活高的同位素标记探针，由于同位素其极其不稳定，因此应该立即使用，不要长久放置。
自备试剂
0.5M EDTA（pH8.0），需要自备标记的核苷酸
自备试剂
0.5M EDTA（pH8.0），需要自备标记的核苷酸
运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期1年
低温运输，-20℃保存，有效期1年
