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埃博拉病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
产品及特点
埃博拉病毒(Ebola Virus, EBOV)是一种单股负链RNA病毒，包含18959个碱基。埃博拉病毒属丝状病毒科，呈长丝状体，长度为970nm，直径大约80nm。埃博拉病毒病是由埃博拉病毒引起的一种罕见但严重的人类疾病，可通过野生动物（如果蝠、豪猪和非人类灵长目动）感染人类，然后通过与感染者的血液、分泌物、器官或其它体液以及被这些液体污染的表面和材料（如被褥、衣服）的直接接触而在人类群体中传播。埃博拉病毒病潜伏期一般为5 到12 天，初始表现为发热、头痛、关节/肌肉和腹痛、伴有腹泻和呕吐。早期埃博拉病毒容易与其他热带病（疟疾、登革热）相混淆，至终末出血期才出现具有特征性的内脏和皮下出血、呕血和眼睛充血。如果失血过多，可导致肾功能衰竭、呼吸困难/衰竭、低体温、休克、弥散性血管内出血和死。调查显示，埃博拉病毒病平均病死率约为50%，在以往爆发的疫情中出现的病死率从25%到90%不等。由于埃博拉病毒感染初期症状无特异性，因此对埃博拉病毒的快速灵敏诊断具有重要意义。本产品以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测埃博拉病毒的试剂盒，它具有下列特点：
使用方法
稀释标准曲线样品以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
产品及特点
埃博拉病毒(Ebola Virus, EBOV)是一种单股负链RNA病毒，包含18959个碱基。埃博拉病毒属丝状病毒科，呈长丝状体，长度为970nm，直径大约80nm。埃博拉病毒病是由埃博拉病毒引起的一种罕见但严重的人类疾病，可通过野生动物（如果蝠、豪猪和非人类灵长目动）感染人类，然后通过与感染者的血液、分泌物、器官或其它体液以及被这些液体污染的表面和材料（如被褥、衣服）的直接接触而在人类群体中传播。埃博拉病毒病潜伏期一般为5 到12 天，初始表现为发热、头痛、关节/肌肉和腹痛、伴有腹泻和呕吐。早期埃博拉病毒容易与其他热带病（疟疾、登革热）相混淆，至终末出血期才出现具有特征性的内脏和皮下出血、呕血和眼睛充血。如果失血过多，可导致肾功能衰竭、呼吸困难/衰竭、低体温、休克、弥散性血管内出血和死。调查显示，埃博拉病毒病平均病死率约为50%，在以往爆发的疫情中出现的病死率从25%到90%不等。由于埃博拉病毒感染初期症状无特异性，因此对埃博拉病毒的快速灵敏诊断具有重要意义。本产品以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测埃博拉病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/μL。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据埃博拉病毒RNA高度保守区设计，不会跟其他的RNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6. 本产品足够50次20μL体系的探针法qRT-PCR反应。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分
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成分 |
规格 |
包装 |
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探针法RT-PCR缓冲液 |
0.5mL |
0.5mL蓝盖管 |
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探针法RT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL红盖管 |
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荧光PCR模板专用稀释液 |
1mL |
1.5mL绿盖管 |
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超纯水 |
1mL |
1.5mL蓝盖 |
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埃博拉病毒qRT-PCR引物-探针干粉 |
1mL |
1.5mL棕色管 |
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埃博拉病毒qRT-PCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL) |
50μL |
0.5mL黄盖管 |
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使用手册 |
1份 |
无 |
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本产品采用五孔盒包装 |
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注 意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入165uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀释标准曲线样品以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同。
3. 在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5μL1×10E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
样品RNA的制备
7. 如果有N个样品，设置N+2个提取，多出的一个是样品制备PC（样品制备阳性对照），一个是样品制备NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备PC。另外用水作为样品制备NC。
8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。
设置qRT-PCR反应20μL体系，在样品制备室进行
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），5个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用试剂盒提供的阳性对照的10000倍稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
数据处理
1. 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
2. 如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
3. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
4. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于35，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于35，则为阴性。如果Ct小于35则为阳性。
自备试剂
样品RNA，超纯水
样品RNA，超纯水
运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期1年
低温运输，-20℃保存，有效期1年
