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  • 柯萨奇病毒A24型变种染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

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    价格:
    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目录号 : TW40180
    • 应用 : 仅供科研使用
    • 保存条件 : 低温/避光保存
    • 货期 : 现货
    • 商品库存:100
      
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产品及特点:
1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。
2. 根据柯萨奇病毒A24型变种的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 检测,灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍,可以达到至少 1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技术,RT 和 PCR 两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 30μL 体系的 RT-PCR。
规格及成分:

编号

成分

规格

试剂一

2×qRT-PCR 缓冲液

500 μL(棕色管)

试剂二

10×qRT-PCR 酶混合液

100 μL(红盖)

试剂三

ROX 染料 I,50×

20 μL(棕色管)

试剂四

ROX 染料 II,50×

20 μL(棕色管)

试剂五

荧光 PCR 专用模板稀释液

1mL(黄盖)

试剂六

柯萨奇病毒A24型变种染料法 qRT-PCR 引物混合液

100 μL(白盖)

试剂七

柯萨奇病毒A24型变种染料法 qRT-PCR 阳性对照 (1×10E8/μL)

50 μL(黄盖)

试剂八

沙核酸释放剂(试用装)

20 次(1mL,绿盖)

试剂九

使用手册

1 份

运输及保存:
低温运输、-20℃保存,有效期一年。
阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供 DNA 片段作为阳性对照。
自备试剂:
样品 RNA。
使用方法: 
一、稀释阳性对照: 
以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例,由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
3. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备:  
5. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。
三、设置 qPCR 反应(20 μL 体系,在样品制备室进行):
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个,其余不变。
8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加):

成分

N+2个制备

所得样品

qRT-PCR

阴性对照

qRT-PCR阳性对照(2-7管)

2×qRT-PCR缓冲液

10μL

10μL

10μL

柯萨奇病毒A24型变种染料法qRT-PCR引物混合物

2μL

2μL

2μL

50×ROX (见注)

0.4μL

0.4μL

0.4μL

样品制备所得RNA

模板(来于第8步)

5.6μL

--

--

稀释所得6个阳性对照 (来于第6步)

--

--

5.6μL2号样到2号 管,3号样到3号管

超纯水

--

5.6μL

--

10×qRT-PCR酶混合液

2μL

2μL

2μL

注: 需使用 ROX 染料 I 的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的机型:ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。

过程

温度

时间

RT(逆转录)

50℃

15-30 min

预变性

95℃

5 min

Qrt-PCR反应40个循环

95℃

15 sec

58℃

1 min,(采集FAM通道的荧光信号)

按仪器预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理:
10. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log 值,再推算出其浓度。
11. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。
五、特别提示:
本公司的所有产品,仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!