HIV-1前病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

产品及特点：

人类免疫缺陷病毒１型(HIV-１)患者血浆中病毒 RNA 水平一直以来是评判抗病毒治疗效果或预测疾病进展的重要指标。但是，经抗病毒治疗后血浆 HIV-１RNA 已达到基线水平感染者的血液、精液或淋巴结中仍可以检测到 HIV-１原病毒 DNA 的存在，构成病毒储藏库，对清除 HIV-１病毒构成严重阻碍。所以在病毒载量已经检测不到的情况下，HIV-１原病毒 DNA 水平可以作为除 CD4+Ｔ细胞计数和病毒载量之外的另一标志物。本公司开发 HIV-1 前病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒，

1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2. 根据HIV-1前病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	2×qPCR MagicMix	500 μL(棕色管)
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL(黄盖)
试剂三	HIV-1前病毒染料法PCR 引物混合液	100 μL(白盖)
试剂四	HIV-1前病毒染料法PCR阳性对照(1×10E8)	50 μL(红盖)
试剂五	DNA 病毒裂解液(试用装)	15 次(9 mL)
	使用手册	1 份

运输及保存：

低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：

DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法：

一、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)：

1.注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。

4.在7号管中加入5μL1×10E8拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5.换枪头，在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6.换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7.重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备：

8.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒DNAout或其升级版柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送15次一管式病毒DNAout。

三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)：

10. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。

11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	PCR阳性对照管(2-7管)
2×qPCR MagicMix(棕色管)	10μL	10μL	各10μL
HIV-1前病毒PCR引物混合液(白盖）	2μL	2μL	各2μL
自备10×ROX(见注)	2μL	2μL	各2μL
N+2待测样品DNA模板	6μL	不加	不加
第7步所得PCR阳性对照稀释液(2-7号)	不加	不加	各6μL2号样到2号管,3号样到3号管

注: 仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

12.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。

过程	温度	时间
预变性	92℃	5分钟
PCR反应30个循环	94℃	60秒
	50℃	60秒
	72℃	60秒

13.数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500nm，最大发射光谱在530nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理：

14.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

五、特别提示：

本公司的所有产品，仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

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HIV-1前病毒染料法荧光定量PCR试剂盒说明书
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