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简介
CD154，也叫CD40配体或CD40L，是一种主要在活化的T细胞上表达的蛋白质，是TNF超家族分子的一员，它与抗原呈递细胞（APC）上的CD40（蛋白）结合，根据目标细胞类型的不同，导致许多影响。CD40L总共有三个结合伙伴：CD40、α5β1整合素和αIIbβ3，在TFH细胞上，CD154通过与B细胞表面的CD40结合，促进B细胞的成熟和功能，从而促进细胞与细胞之间的交流，该基因的缺陷导致无法进行免疫球蛋白类别转换，并与高IgM综合征有关，CD154的缺失也会阻止生殖中心的形成，因此禁止抗体亲和力成熟，这是适应性免疫系统的一个重要过程，CD40配体（CD154）主要在活化的CD4+T淋巴细胞上表达，但也以可溶形式存在。
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物CD40L，清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中CD40L的浓度。
需要的其他材料
1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；
2. 移液器及枪头；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；
6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀释标准品和样品的试管。
样品保存
样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
试剂准备工作
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置
试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从200ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至10ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的10ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将10ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为: 10ng/mL、 5ng/mL、 2.5ng/mL、 1.25ng/mL、 0.625ng/mL、 0.313ng/mL、 0.157ng/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。
抗体工作液配置
使用前10分钟，将100×生物素化抗体于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液，根据所需用量当日配置当日使用。
酶结合物工作液配置
使用前10分钟，将100×SA-HRP溶液于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。
备注：如待测样本中CD40L浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数。
结果的计算
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。
若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
示例数据
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。
|
标准品浓度(ng/mL) |
10 |
5 |
2.5 |
1.25 |
0.625 |
0.313 |
0.157 |
0 |
|
OD值 |
2.434 |
1.668 |
0.98 |
0.745 |
0.426 |
0.229 |
0.172 |
0.069 |
|
校正OD值 |
2.365 |
1.599 |
0.911 |
0.676 |
0.357 |
0.16 |
0.103 |
0 |
下图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果
重复性
板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。
灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.08ng/mL。
特异性
该试剂盒测定可识别重组大鼠CD40L。
其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。
