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小反刍兽疫病毒探针法qRT-PCR试剂盒(含内参)
产品及特点
小反刍兽疫病毒（Peste Des Petits Ruminants Virus，PPRV）在分类上属于属副粘病毒科、麻疹病毒属，是单股负链 RNA病毒，基因组大小约为15948 nt。小反刍兽疫主要感染山羊、绵羊等小反刍动物，也可感染猪和牛。感染小反刍兽疫病毒会引起的山羊和绵羊的急性接触性传染病，临床以发热、口炎、腹泻和肺炎为特征，会造成感染动物大面积死亡，从而给养殖业造成不可避免的损失。因此快速灵敏诊断小反刍兽疫病毒具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测小反刍兽疫病毒的含内参试剂盒，它具有下列特点：
小反刍兽疫病毒（Peste Des Petits Ruminants Virus，PPRV）在分类上属于属副粘病毒科、麻疹病毒属，是单股负链 RNA病毒，基因组大小约为15948 nt。小反刍兽疫主要感染山羊、绵羊等小反刍动物，也可感染猪和牛。感染小反刍兽疫病毒会引起的山羊和绵羊的急性接触性传染病，临床以发热、口炎、腹泻和肺炎为特征，会造成感染动物大面积死亡，从而给养殖业造成不可避免的损失。因此快速灵敏诊断小反刍兽疫病毒具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测小反刍兽疫病毒的含内参试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3. 提供阳性对照，便于制备标准曲线和用作扩增对照，排除假阴性结果。
4. 含识别内源性内参的引物和探针，便于排除RT-PCR假阴性样本。
5. 特异性高，靶分子的引物和探针是根据小反刍兽疫病毒RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
6. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为5个数量级。
7. 本产品足够50次20 μL体系的探针法RT-PCR反应。
8. 本产品只能用于科研。
规格及成分
规格及成分
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成分 |
规格 |
包装 |
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探针法 qRT-PCR 缓冲液 |
500μL |
0.5mL蓝盖管 |
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探针法qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL红盖管 |
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荧光PCR专用模板稀释液 |
1mL |
1.5mL绿盖管 |
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小反刍兽疫病毒RT-PCR引物-探针干粉（含内参引物探针） |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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小反刍兽疫病毒RT-PCR阳性对照(1E7拷贝/μL) |
50μL |
0.5mL黄盖管 |
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使用手册 |
1份 |
无 |
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本产品采用五孔盒包装 |
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注 意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入220 μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀释标准曲线样品以阳性对照1E1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例
稀释标准曲线样品以阳性对照1E1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例
1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
2. 在各管中加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液。
3. 在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线阳性样品。放冰上待用。
样品RNA的制备
7. 如果有N个样品，设置N+2个提取，多出的一个是制备PC（样品制备阳性对照），一个是制备NC（样品制备阴性对照）。可以用确认是阳性的样本作为阳性对照，用确认是阴性的样本作为阴性对照。
8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
Probe qRT-PCR反应20 μL体系，在样品制备室进行
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
数据处理
1. 阴性阳性判断：没有Ct读数，或Ct大于40判为阴性结果。有Ct读数，Ct值小于40，荧光信号有对数增长，有典型扩增曲线判为阳性结果。每个样本需要对FAM通道和Cy5通道的结果分别进行判定，得到两个结果。
2. 实验有效性判断：如果扩增阳性对照或制备阳性对照FAM通道结果为阴性则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析原因，可能是操作、仪器和试剂三方面的原因，重做扩增或制备或跟仪器和试剂厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照FAM通道结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析失败原因，直到污染消除。如果阳性对照和阴性对照正常，则进入下一步分析样本的有效性。
3. 样本有效性判断：如果样本FAM通道的结果为阳性，则无论内参通道的结果是阴性还是阳性，样本的结果均有效。如果样本结果为阴性，内参通道结果也为阴性，则此样品的阴性结果无效。此样品需要重新提取核酸和进行扩增。
4. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，分别以阳性对照FAM通道和内参通道的Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照FAM通道读数的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95，内参通道读数的标准曲线为一条跟X轴平行的横线。再以待测样品的Ct值从阳性对照FAM通道读数的标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
5. 如果用于定性实验，对待测样品，如果其FAM通道的Ct没有读数、或Ct大于或等于40则均为阴性，如果小于40则为阳性。对任何FAM通道结果为阴性的待测样本，如果其对应的内参通道也为阴性，则此样品的阴性结果无效，此样品需要重复实验。
自备试剂
样品RNA
样品RNA
运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期2年
低温运输，-20℃保存，有效期2年
