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品质保证 · 通蔚试剂

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最新产品

  • 探针法qPCR试剂盒

    乙型肝炎病毒前基因组RNA 探针法qRT-PCR试剂盒

    规格：
    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目录号 : TW-E10493
    • 应用 : 仅限于科研使用
    • 货期 : 2年
    • 规格 ：50T
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产品及特点

乙型肝炎病毒前基因组RNA简称HBV pgRNA (Hepatitis B Virus pregenomic RNA，pgRNA)，它是肝细胞内HBV cccDNA转录得到的RNA。研究显示，对治疗中的慢性乙型肝炎患者，当病毒的逆转录和DNA合成被抑制后，其血清中的HBV RNA水平能反映肝细胞内cccDNA的存在及其转录活性，而且还证实了慢性乙型肝炎患者血清中存在的HBV RNA为3.5kb大小的前基因组RNA，这些pgRNA是以HBV RNA病毒样颗粒形式存在于成熟病毒颗粒的核衣壳内，并和持续的病毒感染及病毒学反弹风险相关，因此快速灵敏诊断乙型肝炎病毒前基因组RNA具有重要意义。本产品以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到1000拷贝/反应。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据乙型肝炎病毒前基因组RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6. 本产品足够50次20μL体系的探针法qRT-PCR反应。
7. 本产品只能用于科研。

规格及成分

成分

规格

包装

探针法qRT-PCR缓冲液

500μL

0.5mL蓝盖管

探针法qRT-PCR酶混合液v2

50μL

0.5mL红盖管

荧光PCR专用模板稀释液

1mL

1.5mL绿盖管

乙型肝炎病毒前基因组RNA qRT-PCR引物-探针干粉

50次

1.5mL棕色管

乙型肝炎病毒前基因组RNA RT-PCR阳性对照

(1×10E7拷贝/μL)

50μL

0.5mL黄盖管

使用手册

1份

无

本产品采用五孔盒包装

注 意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。


使用方法

稀释标准曲线样品以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光RT-PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同）。
3. 在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在4号管中加入5μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

样品RNA的制备
7. 如果有N个样品，设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
Probe qRT-PCR反应20μL体系，在样品制备室进行
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

数据处理
1. 如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行PCR扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
2. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
3. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
4. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须没有读数，或者大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40。对待测样品，如果其Ct没有读数、大于或等于40则均为阴性，如果小于40则为阳性。

自备试剂

样品RNA

运输及保存

低温运输，-20℃保存，有效期1年