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芽孢杆菌通用探针法qPCR试剂盒
产品及特点
芽孢杆菌（Bacillus）属于芽孢杆菌科芽孢杆菌属，为革兰氏阳性菌。细胞呈直杆状，常以成对或链状排列，具圆端或方端。芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力强、分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处，在工农业及医药生产中均有广泛应用，因此快速检测芽孢杆菌具有重要意义。为此本公司以探针法qPCR技术为基础开发了芽孢杆菌的检测试剂盒，它具有下列特点：
产品及特点
芽孢杆菌（Bacillus）属于芽孢杆菌科芽孢杆菌属，为革兰氏阳性菌。细胞呈直杆状，常以成对或链状排列，具圆端或方端。芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力强、分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处，在工农业及医药生产中均有广泛应用，因此快速检测芽孢杆菌具有重要意义。为此本公司以探针法qPCR技术为基础开发了芽孢杆菌的检测试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到100拷贝/反应。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据芽孢杆菌基因组DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量时线性范围至少为5个数量级。
6. 本产品足够50次20μL体系的探针法qPCR反应。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分
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成分 |
规格 |
包装 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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荧光PCR专用模板稀释液 |
1mL |
1.5mL绿盖管 |
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超纯水 |
1mL |
1.5mL蓝盖管 |
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芽孢杆菌通用qPCR引物-探针干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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芽孢杆菌通用阳性对照(1E7拷贝/μL) |
50μL |
0.5mL黄盖管 |
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使用手册 |
1份 |
无 |
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本产品采用五孔盒包装 |
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注 意：引物-探针干粉在使用前需要离心，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀释标准曲线样品以1E1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供DNA片段作为阳性对照。
稀释标准曲线样品以1E1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头（下同）。
3. 在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡混匀1分钟，得到1E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡混匀1分钟，得到1E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL的阳性对照(上步所得)，充分震荡混匀1分钟，得到1E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 依次重复上面的操作得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
样品DNA的制备
7. 如果有N个样品，设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
Probe qPCR反应20μL体系，在样品制备室进行
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
数据处理
1. 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
2. 如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
3. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
4. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。
自备试剂
超纯水，样品DNA
超纯水，样品DNA
运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期2年
低温运输，-20℃保存，有效期2年
