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简介
尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)是一种由NOX4基因编码的酶，是NADPH氧化酶NOX家族中的一员，它是一种吞噬细胞型氧化酶，类似于负责在中性粒细胞中产生大量活性氧（ROS）并由此产生抗菌活性的氧化酶，已被推测在肾脏中作为氧传感器发挥作用，调节肾皮质中红细胞生成素的合成，Nox4保护血管免受炎症压力，氨基内酯对Nox依赖性活性氧 的调节可以诱导Nox4高表达的癌细胞发生凋亡。
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物NOX4，清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中NOX4的浓度。
需要的其他材料
1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；
2. 移液器及枪头；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；
6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀释标准品和样品的试管。
样品保存
样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
试剂准备工作
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置
试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从400ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至20ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的20ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将20ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为： 20ng/mL、 10ng/mL、 5ng/mL、 2.5ng/mL、1.25ng/mL、 0.625ng/mL、 0.313ng/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。
抗体工作液配置
使用前10分钟，将100×生物素化抗体于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液，根据所需用量当日配置当日使用。
酶结合物工作液配置
使用前10分钟，将100×SA-HRP溶液于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。
备 注：如待测样本中NOX4浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数。
结果的计算
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。
若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
示例数据
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。
|
标准品浓度(ng/mL) |
20 |
10 |
5 |
2.5 |
1.25 |
0.625 |
0.313 |
0 |
|
OD值 |
2.449 |
1.741 |
0.945 |
0.642 |
0.408 |
0.265 |
0.182 |
0.058 |
|
校正OD值 |
2.391 |
1.683 |
0.887 |
0.584 |
0.35 |
0.207 |
0.124 |
0 |
下图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果
重复性
板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。
灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.16ng/mL。
特异性
该试剂盒测定可识别重组大鼠NOX4。
其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。
