【通蔚生物】：禽肺病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒产品特点及使用方法

通蔚生物禽肺病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒产品特点及使用方法如下：

产品及特点：
禽肺病毒(AvianPneumovirus，APV)会引起禽肺病毒感染，鸡和火鸡是本病的自然宿主，雉鸡、珍珠鸡和鹌鹑可被感染。该病毒主要经接触传播，病禽及康复禽是主要传染源。幼龄鸡感染后临床症状：气管锣音，打喷嚏，流鼻液，泡沫性结膜炎，眶下窦肿胀和颈下水肿，严重者咳嗽、甩头。蛋鸡感染后临床症状：种鸡和产蛋鸡通常在产蛋高峰期发病，产蛋量下降5%-30%，有时下降70%，严重者导致输卵管的脱垂；鸡蛋皮薄、粗糙，种蛋孵化率降低。该病毒对养鸡业会造成较大的经济损失，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于PCR原理开发。
1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2.根据禽肺病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品足够50次30μL体系的RT-PCR。
运输及保存：
低温运输、-20℃保存，有效期一年。
阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供DNA片段作为阳性对照。
自备试剂：
样品RNA。
使用方法：
一、稀释阳性对照：
以10E2-10E7这6个10倍稀释度为例，由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
2.在7号管中加入5μL1×10E8拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
3.换枪头，在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备：
5.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
6.用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。
三、设置RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）：
7.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
8.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
注：需使用ROX染料I的机型：ABIPrism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-OnePlus。
需使用ROX染料II的机型：ABIPrism7500、7500Fast、MJResearch的Chromo4、Opticon(II)CorbettRotorGene3000。
不需要使用ROX的机型：ThermalCycleDiceRealTimeSystem，LightCycler、SmartCyclerSystem、AgilentMx3000P、RotorGene3000、RotorGene6000。
9.上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
四、数据处理：
10.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
11.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
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