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【通蔚生物】:ELISA试剂盒实验操作秘籍大公开

发布时间:2024-01-10     发布作者:上海通蔚生物

通蔚生物教您如何利用ELISA试剂盒选以及ELISA方法操作的注意事项有哪些呢?相信很多做实验的小伙伴都有这样的疑问,今天小编就给大家总结一下,注意听讲哦!
ELISAs试剂盒
ELISA,全称酶联免疫吸附实验,主要利用的是抗原抗体特异性结合的特点,可分为直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等。下面以间接法为例进行介绍:
1、方阵ELISA。用途:①融合前后确定鼠血清中抗体效价;②拿到单抗腹水后,需要建立ELISA方法时首先要确定包被原及抗体的优质工作浓度。
经典的方阵ELISA:将抗原和抗体各自稀释成不同梯度浓度,结果OD值P/N>2的均判为阳性,选取OD值在1.0左右的那个Ag-Ab浓度为工作浓度,其主要原因与酶标仪灵敏度有关。但是,对于抗原抗体而言,由于它们被稀释成不同浓度,那么在理论上,每个抗原稀释度情况下,总有一个抗体的稀释度其OD值在1.0左右,那么到底选取哪一个OD值1.0左右的好呢?这就需要同时用药物做个抑制来看,哪个浓度下抑制情况好,就取哪个抗原抗体浓度做工作浓度。
2、间接竞争ELISA:在用方阵ELISA确定好抗原抗体醉佳结合浓度后就可以做间接竞争ELISA了,其目的主要是考察抗体的特异性、绘制标准曲线,计算抗体对抗原的半数抑制、检测限等参数,也可以用来检测未知样品中的抗体。方法是用确定的抗原包被,在加一抗时同时加入不同浓度的标准品(一般是药物),然后加二抗,显色。用药物(即标准品)浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标,绘制ELISA标准曲线,计算相关的参数,之后就可以将未知的样品所测OD值代入曲线方程求其中抗体的含量。通常这是建立ELISA检测方法的项目。
标准曲线可以绘成直线或是曲线(二次方程或三次方程)。通常是选取线性比较好的几个点绘成直线。直线斜率越高说明抗体的特异性及灵敏性好,R2值越靠近1,则说明线性关系好。曲线绘好后,有一些常用的参数,如抑制率、半数抑制、检测限、定量限、标准偏差、变异系数等等:
抑制率(%)=1-B/B0(B0为不含药物的OD值;B为含有药物的OD值)标准差(SD)=[∑(Xi-B ) 2 / (n-1)] 1/2;标准偏差(RSD)=SD/B
半数抑制:指用药物(半抗原)去做竞争实验时呈现50%抑制效果时的药物浓度。药物浓度越低,而抑制率越高,则表示抗体对药物的特异性越好,灵敏度也高。半数抑制浓度IC50对应的OD值:OD IC50=0.5B0;检测下限(LOD)对应的OD值:ODLOD =B0-3SD;定量限(LOQ)对应的OD值:ODLOQ = B0-10SD;
3、间接ELISA操作中具体注意的问题:

间接ELISA试剂盒一般有6个步骤:包被抗原、封闭、加一抗(在做竞争时同时加入药物)、加二抗、显色、终止。其中除了加显色和终止外,其余步骤之间都要进行洗板。在这里面,每一步都非常重要,假如有一步疏忽都会造成结果的不准确。

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