ELISA试剂盒背景值高？别怕！新手也能轻松搞定

  在科研实验中，在进行ELISA试剂盒实验过程，通常会遇到一些常见问题——ELISA高背景问题。高背景信号会降低 ELISA 的灵敏度和特异性，并影响结果的准确性。它可能导致假阳性结果，或掩盖低浓度待测物的信号。因此，减少ELISA背景噪音有助于提高实验的准确性，为了实验准确性，下面通蔚生物为大家盘点一些影响因素，对于噪音困扰，你可以对照这些因素来试着解决。如果还未解决，也可以寻求我们在线技术顾问。

  因素一、洗涤不充分

  在ELISA实验步骤中要涉及到洗涤，如果不充分的洗涤，会未结合的物质（例如非特异性结合的抗体或检测试剂）残留在微孔板孔中，它会增加背景噪音。如有必要，可以通过增加洗涤缓冲液中的盐浓度来阻止非特异性结合相互作用。如果背景太高并且您怀疑洗涤步骤不充分，在适当的情况下向洗涤缓冲液中添加洗涤剂或蛋白质，或者在两次洗涤之间浸泡几分钟。

  因素二、封闭问题

  在ELISA实验步骤中涉及到封闭，封闭不充分可产生信号的抗体非特异结合的机会。这时，我们会用封闭缓冲液，封闭缓冲液的作用是用非特异性结合的不相关蛋白质（或多种蛋白质）浸泡板或微孔中的潜在结合位点（基本上是任何剩余的粘性点）。这随后减少了信号产生抗体非特异性结合的机会。

  在实验之后，你可能会发现背景较高，如果您怀疑是封闭不足，您可以尝试使用更高浓度的封闭剂，或增加封闭时间。希望阻断剂不会掩盖抗体抗原上的结合位点。

  市面上的封闭剂分2种类型：蛋白质和非离子去垢剂。具体使用哪种类型取决于许多因素，包括板的表面化学、吸附在其上的抗原、抗体和检测试剂。

  最常见的非离子洗涤剂阻滞剂是Tween-20。去垢剂阻滞剂价格便宜、稳定，并且可用于去除洗涤步骤中的一些非特异性结合。它的缺势是它们很容易被洗掉。因此，所有洗涤溶液中也必须添加洗涤剂阻滞剂。注意不要使用高浓度（正常浓度约为0.01-0.1%），这会减少特异性结合并产生假阴性。另一种选择是同时使用蛋白质和非离子洗涤剂阻滞剂，后者可以在洗涤步骤中帮助阻滞。

  与洗涤剂不同，蛋白质阻滞剂是永久性的。它们与开放空间结合并封闭它们，并且还稳定与微孔板结合的抗原分子。洗掉多余的封闭缓冲液后，蛋白质封闭剂仍然存在（与去污剂封闭剂不同）。常见的蛋白质阻滞剂包括牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉、普通全血清和鱼明胶。对于主要的阻断问题，使用全血清作为阻断剂可能很有吸引力，因为血清成分固有的多样性使其能够有效阻断许多不同类型的分子相互作用。然而，全血清的缺点是它会与检测反应中常用的ProteinA和抗IgG抗体发生交叉反应。解决这个缺点的一个方法是使用来自鸡或鱼的完整正常血清。

  其实封闭是ELISA实验比较关键的一个步骤，大家在做实验时，可以查看你具体使用的封闭试剂，在实验过程持续优化。

  问题三、抗体浓度过高或低

  抗体浓度过高会增加非特异性结合，抗体浓度过低会降低检测灵敏度。大家在进行ELISA实验之前，可以参考剂盒说明书，商业 ELISA 试剂盒通常会提供建议的抗体浓度范围，可以作为参考。

  问题四、检测试剂不合理

  在ELISA实验过程，检测试剂使用合理非常重要！使用浓度过高或稀释不当，可能会导致背景较高。不要使用检测试剂过度显色-如有必要，优化何时使用终止液。

  上述是ELISA实验中背景过高因素及问题优化办法，其实背景问题不要过于担心，在实验过程多总结多尝试这些问题后续也会消失！如果在使用ELISA试剂盒遇到问题，也可以和我们在线顾问寻求帮助！